第六章DNA序列多态性分析

待测DNA片段，使其变性。 2.选择一条与DNA单链互补的短链引物，引物先同单 链模板复性 3.引物的延长和合成阻断

4个试管分别加入：模板、DNA聚合酶、dNTP-标记底物 （32P等） 终止剂不同 ddATP ddGTP ddCTP ddTTP 4个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链
•聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分 长度只差一个核苷酸的DNA分子。 • 利用DNA聚合酶不能够区分 dNTP和ddNTP的特性，使 ddNTP参入到寡核苷酸链的3’末端。因为ddNTP 3’不是-OH， 不能与下一个核苷酸聚合延伸， 从而终止DNA链的增长。
技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
C： ASO探针与 PCR产物杂交反应： 高强度杂交-温度高，离子强度低。特异不利于复性。 低强度杂交-温度低，离子强度高。利于复性不特异。 D：洗去未结合 /结合不牢固的非特异性探针 ;
E：检测标记物是否存在。
杂交分类
正向杂交
固定PCR 产物；标记探针 ；
反向杂交 固定探针；标记PCR 产物－－ DNA 芯片技术
第六章DNA序列多态性分析
（Analisis of Sequence Polymorphism）
教学要求


一、掌握DNA序列多态性概念；了解DNA序列测定及多 态性分析基本技术。熟悉法医学应用价值评价。 二、了解等位基因特异性探针杂交技术基本原理、技术及 方法、常用遗传标记系统。 三、了解扩增片段限制性长度多态性（PCR-RFLP）分 析的基本原理、技术、方法及常用遗传标记系统、法医学 应用。 四、了解MVR-PCR序列多态性分析技术的基本原理技 术，常用遗传标记系统、基本分型方法及法医学应用。 五、了解序列多态性的其他分析技术。
DNA测序的两种经典方法： 双脱氧核苷酸链终止法（the chain termination method）
单链DNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的合成来 判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。
化学降解法（chemical degradation method）
双链DNA分子被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被 切开，从而确定DNA分子的序列。
1. 相关概念： A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照碱基互 补的原则复性为双链的过程。 B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸 序列并与之退火杂交的具有以知序列的寡核苷酸单 链。 2. 探针的条件: A: 长度为20bp左右。 B：具备高度特异性。 C：容易标记示踪物。 D：在杂交过程中本身性质稳定。
在每一反应试管中，都加入 一种互不相同的ddNTP和 全部4种dNTP，其中 ddNTP带有32P同位素标记。 反应混合物样品加在聚丙烯 酰胺凝胶中，按片段大小进 行电泳分离。谱带的判读是 从胶的底部开始，所得的核 苷酸碱基顺序，与模板链为 互补链。
Sanger双脱氧末端终止法测序过程
1.用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增
；
（三）荧光标记循环测序全自动分析
1. 荧光标记循环测序步骤
1）模板制备：PCR扩增 2）反应体系：含适量的模板、引物、dNTP、 荧光标记的ddNTP、DNA聚合酶、缓冲体 系。 3）PCR热循环参数：94℃-1min；40～ 60℃-30s；72℃延伸30s，共20～40个 循环。
1. 荧光标记循环测序步骤
AB 3730XL全自动基因分析仪
双光束双侧激发激光， 光栅分光装置和后置超 薄CCD检测成像系统； 内置一体化自动进样器 及样品孔打孔装置；内 置样品板条形码自动识 别；含96根毛细管可同 时在2.5小时内测定96 个样品；自动碱基识别 与质量评分判定；新型 POP-7液体分离胶；电 泳温度范围18-70℃； 使用50cm毛细管,可使 读序长度达1100bp， 精确度800bp以上。
测序的DNA多聚酶
目前普遍采用的测序酶为Sequenase, 来自T7噬菌体
链终止反应要求单链作为模板 如何得到单链DNA ？

将DNA克隆到质粒载体 这种方法是获得测序模板DNA最常用的方法。 获得的DNA通过热变性或者碱变性转变为单链DNA进 行测序。

优点：可双向测序。

缺点：样品可能有少量细菌的DNA或者RNA污染，会
效率低（人工判读等） 时间毒性（放射性标记物）
（二）循环测序 （cycle sequencing） 1．基本原理：
然后再利用 PCR 直接测定序列； 采用了PCR热循环高效合成 DNA 的特性并 结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的 延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因 此称为循环测序。
4）纯化扩增产物，在DNA测序仪上电泳（变 性聚丙烯酰胺凝胶或毛细管电泳），经激光 发射装置激发荧光标记的ddNTP，使后者产 生不同的激发光； 5）收集信号不同的ddNTP 呈现不同颜色； 6）电泳结束后，由相应的序列分析软件分析 数据，得到核酸序列。
荧光标记ddNTP
（三）荧光标记循环测序全自动分析
循环测序法
含靶DNA片 PCR扩增 段的重组体 靶序列模
板
Radioactively labeled with 32P
PCR循 环反应
Biblioteka Baidu
55℃水浴中 保温30min
循环测序反应与普通PCR反应比较
循环测序反应
引物 底物 产物增长 一条 dNTP＆ddNTP 线形方式
普通PCR反应
两条 dNTP 指数形式
三、常用遗传标记系统
（一）HLA-DQA HLA-DQAl 基因座反向斑点杂交检测是法医学 应用最早的 PCR 技术序列多态性分型技术。 （二）Polymarker系统。 PM 系统包括LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和 GC 等5个多态性DNA基因座。这 5个基因座彼此 独立，没有连锁关系，系统识别率是各基因座的 乘积，因此系统具有较高识别能力，在法医学应 用中具有重要价值。
先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，
（二）PCR循环测序
每个测序循环包括：
①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形 式；②标记引物与其中的一条链上的互补序 列退火； ③退火后的引物在耐热DNA聚合 酶催化下发生链延伸终止反应。 上述循环步骤重复20~40次，使链终止 产物以线性方式获得扩增。
法医学上常用的序列多态性分析技术
DNA序列分析——mtDNA分型 PCR-ASO技术——HLA-DQAl
基因座 mtDNA
PCR-RFLP技术——ABO基因、
第一节 双脱氧核苷酸链终止法测序
Sanger测序及其改进方法
Sanger双脱氧末端终止法
（32P标记、放射自显影）
PCR循环测序



PCR产生单链DNA
引物决定模板链的测序起点
Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 1) 含靶DNA片 段的重组体
Radioactively labeled with 32P
Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 2)
序列多态性的检测方法







经典测序技术（双脱氧核苷酸链终止法和化学裂解法) 等位基因（序列特异性）寡核苷酸 探针杂交（ASO-PCR） 技术 扩增限制性片段多态性技术( PCR-RFLP ) 序列多态性分析技术（ MVR-PCR ） DNA芯片(DNA Chip) 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（ MALDI-TOF-MS） 变性高效液相色谱法(TmHPLC) 焦磷酸测序技术 微测序方法 实时荧光定量PCR技术
循环测序的优点
简单、易操作；
PCR产物3～10ng； 减少模板的二级结构； 适合于双链及单链DNA测序； PCR产物可直接测序，效果好。
所需模板DNA量少
（三）荧光标记循环测序全自动分析
4种不同荧光染料标记ddNTP PCR循环扩增在同1管中； PCR仪上进行热循环反应； 单道凝胶电泳或毛细管电泳； 激光检测装置； 计算机自动分析结果。
3. 对示踪物的要求 A: 高灵敏度。 B: 不影响探针的特异性。 C: 不影响探针的杂交特性。 D：不改变本身的特性。 E：检测方法特异。 F：安全可靠无公害。 G：检测方法简单，重复性好。
二、基本过程
PCR- ASO探针杂交： A：针对序列多态等位基因序列设计特异性探针 ;
B： PCR 扩增各等位基因，变性;
4.电泳： ACGT次序
4道凝胶高压电泳 5.放射自显影得到直读图谱。
链终止法对DNA多聚酶的要求
酶活性高 保证不会反应提前终止 无5’ →3’外切酶活性 保证不切除新合成链的5’端，改变链长度，给读序造成误 差 有3’ →5’外切酶活性 校正引物3端错配碱基 保证不切除新合成链的3’端，改变链长度，给读序造成误 差
3.三种方法比较
反应管 反应条件 链终止法 4个
55 ℃ 30min
循环测序 4个 PCR循环
同位素（32P）
自动测序 1个 PCR循环
标记物 标记对象 电泳方式
图谱显示 序列分析
同位素（32P）
ddNTP 4道凝胶 X光胶片 人工判读
Primer 4道凝胶 X光胶片 人工判读
荧光染料 ddNTP 1道凝胶/毛 细管 激光荧光检 测 计算机自动 分析
干扰测序。
将DNA克隆到M13噬菌体载体

M13噬菌体载体是专为得到单链DNA测序模板而设 计的。 M13噬菌体本来含有单链DNA基因组，感染大肠杆 菌的M13可转变为双链复制型。 M13噬菌体载体是 双链的，相当于M13噬菌体的复制型。 用含有待测序片段的M13噬菌体载体感染大肠杆菌， 大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链DNA基因组。 缺点：只能用于短片段DNA，大于3kb的片段在克隆 过程中会发生缺失和重排。
ＤＮＡ自动测序技术（ 标 记引物或ddNTP）
Sanger 双脱氧链终止 DNA测序法：
利用DNA聚合酶和双 脱氧链终止测定DNA核 苷酸顺序的方法，是由 英国剑桥分子生物学实 验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发 明的。
1980年诺贝尔奖金获得者F. Sanger
Sanger 双脱氧链终止DNA 测序法的基本原理：
核染色体STR分型局限性
作案现场只发现有头发或长期暴露
于外界环境的骨骼，这些检材中核 DNA含量很少或降解，无法进行 STR分型。
DNA序列多态性 （DNA sequence polymorphism）
概念：基因组DNA核苷酸序列在不同个体间最本
质的遗传差异，在特定的基因座上不同个体的等 位基因之间由碱基序列差异构成的DNA多态性叫 做序列多态性。 同一个体的不同组织细胞中的基因组DNA序列是 相同的，这是根据DNA序列认定同一性的前提条 件。 主要包括线粒体序列多态性和核基因组单核苷酸 多态性。 人类基因组计划完成，序列多态性的研究将成为 新兴热点。
第二节 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术
（allele specific oligonucleotide,ASO）
根据碱基互补的原则,制备识别特定 寡核苷酸序列的单链DNA探针,并标记 示踪物,在高强度条件下与变性DNA样 品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应 的等位基因。
核酸分子杂交反应 一、基本原理：
PCR扩增 靶序列模 板 4种不同荧光 染料标记置于 1管中
PCR循环
激光检 测装置
荧光检测自动分析序列
2.荧光标记循环测序全自动分析优点
4种不同荧光染料标记ddNTP反应同1管中； PCR仪上进行热循环反应； 激光检测装置：单道凝胶电泳或毛细管电泳； 计算机自动分析结果。
快速、简便、自动化分型等优点
Radioactively labeled with 32P
55℃水浴中 保温30min
Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 3)
高压凝胶电泳 与放射自显影
高压凝胶电泳与 放射自显影
人工判读图谱
Sanger测序方法的局限性
操作繁琐（准备模板、4管反应、4道电泳）