A型产气荚膜梭菌的分离及鉴定(1)

Ａ型产气荚膜梭菌的分离及鉴定

高文伟１，郭宏伟１，任家琰１，蒋玉文２，杨茂荣３，赵玉臣３，柴奎强３，周县利３

（１山西农业大学动物科技学院，太谷０３０８０１；２

中国兽药监察所，北京１０００８１；

３

山西省药物培植场，降县０４３６００）

摘要：从山西各鹿场采集鹿出血性肠炎急性病死鹿病料３９例，通过病原微生物分离培养，形态学观察和血清型鉴定，初步表明分离到的产气荚膜梭菌主要是Ａ型，对ＰＣＲ产物的序列分析表明经过

ＰＣＲ得到了特异性的α毒素基因片段，因而Ａ型产气荚膜梭菌是引起山西鹿场发生鹿出血性肠炎

的主要致病菌。为该疾病的防治和疫苗研制提供依据。关键词：山西鹿场；Ａ型产气荚膜梭菌；分离；鉴定中图分类号：Ｓ８５２．６

文献标识码：Ａ

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＧａｏＷｅｎｗｅｉ１，ＧｕｏＨｏｎｇｗｅｉ１，ＲｅｎＪｉａｙａｎ１，ＪｉａｎｇＹｕｗｅｎ２，ＹａｎｇＭａｏｒｏｎｇ３，

ＺｈａｏＹｕｃｈｅｎ３，ＣａｉＫｕｉｑｉａｎｇ３，ＺｈｏｕＸｉａｎｌｉ３

（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１；２ＴｈｅＡｎｉｍａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ

Ａｃａｄｅｎｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１；３ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＦｉｅｌｄ，Ｊｉａｎｇｘｉａｎ０４３６００）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ３９ｃａｓｅｓｏｆｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅｍａｊｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘａｍｉｎｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ，ｔｈｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｅｒｕｍｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｉｔｉｓｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｏｔｈｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗａｓｍａｄｅｔｈａｔｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｔｈａｔｃａｕｓｉｎｇｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｆｏｒｅｐｒｏｖｉｄｅｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｈａｎｘｉｃｅｒｖｕｓｆａｒｍ，ｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

基金项目：山西省攻关项目“鹿出血性肠炎多价疫苗的研制”（０１２０２９）。

第一作者简介：高文伟，女，１９７０年出生，山西翼城县人，讲师，硕士，主要从事家畜寄生虫的教学和研究工作。通信地址：０３０８０１山西省太谷县山西农

业大学动物科技学院，Ｔｅｌ：０３５４－６２８８５２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｎｄｇａｏｗｅｎｗｅｉ＠１６３．ｃｏｍ。

通讯作者简介：任家琰，硕士生导师，教授，主要从事兽医微生物及免疫学的教学和研究工作。收稿日期：２００７－０３－２２，修回日期：２００７－０４－１８。

目前，中国鹿养殖量逐渐增加，主要集中在东北和华北地区，山西鹿的存栏量位居全国前列，而且不断呈上升态势。但随着养鹿业的大规模发展，全国各地养鹿场出现了一种以膘情较好的青年公鹿多发的发病急、死亡快、病死率高、以肠道出血为主要特征的

疾病，给养鹿业造成很大的损失［１～４］

。通过流行病学调查证明，在中国饲养的鹿中出血性肠炎发病率居首位，是对中国养鹿业威胁较大的传染病之一［５，６］。对于本病的治疗，理论上讲可以用一些抗生素及磺胺类药物等进行对症治疗，但由于患畜发病一般都比较急，所以多来不及治疗已死亡，而病势较缓的，即使用这些

药物治疗，效果也很不理想［７～９］

，因此对于该病的防治，免疫预防尤为重要。而根据病原菌致病机理和免疫学

特性，选用当地分离的菌种制成鹿源灭活苗免疫，能更确实可靠的预防本病流行。所以该试验对山西某些鹿场发生鹿出血性肠炎急性病死鹿的病料进行采集，通过对病原体进行鉴定，为后期研制多价的地方苗奠定基础。

１材料与方法１．１试验材料

１．１．１试验动物普通级昆明系小白鼠，体重１６～

１８ｇ，

购自山西医科大学试验动物中心。

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ

１．１．２病料共采集病料３９例。分别采自山西省阳泉市北庄鹿场，燕龛鹿场，昔阳县大寨鹿场等发生出血性肠炎的病死鹿。在鹿死亡２４ｈ内采集病死鹿的肝、脾、肾、肠系膜淋巴结、病变小肠及其内容物或发病期间的血便。同时调查死亡鹿的发病史，临床症状，观察死后鹿各脏器的病变情况。在病料采集过程中要尽可能避免污染，将采集的病料置于冰壶，迅速送实验室检测或－２０℃低温保存。

１．１．３产气荚膜梭菌分型血清产气荚膜梭菌Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ分型血清，购自中国兽药监察所（批号：２００５０３１２１４５）。

１．１．４标准菌株购自中国兽药监察所，菌株编号：Ａ型产气荚膜杆菌ＡＴＣＣ１３１２４。

１．２试验方法

１．２．１细菌的分离纯化①显微镜检查：取病死鹿的肝脏和空肠、回肠、盲肠、结肠等内容物或粘膜抹片，革兰氏染色后，在显微镜下观察。②细菌溶血性检查：分别取产气荚膜梭菌疑似菌落接种于血平板，３７℃培养１８～２４ｈ，观察血平板上是否有产气荚膜梭菌特有的α、β双溶血环。③细菌的纯化：分别从血平板上挑取有清晰双溶血环的产气荚膜梭菌典型菌落，接种于血斜面，３７℃恒温培养箱中厌氧培养２４ｈ，取出后置２５℃有氧环境１ｈ，染色、镜检，并观察血斜面上的菌落特性。同时接种厌氧肉肝胃酶消化汤，３７℃厌氧培养１８ｈ，革兰氏染色、镜检。④生化试验：将已纯化的细菌培养物接种于各种生化培养基中，包括糖发酵试验（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、甘露醇、棉子糖等），吲哚试验，Ｈ２Ｓ试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，卵磷脂试验，石蕊牛乳发酵试验等，３７℃厌氧培养２４ｈ，通过其生长表现判定细菌种属。

１．２．２血清型鉴定取分离纯化的典型菌落，接种培养，离心，然后取上清夜，分２份；第一份菌液按（表１）分别加样入５支灭菌小试管中，同时置３７℃恒温箱中作用４０ｍｉｎ，之后将每管混合液注射小白鼠，２只／管，０．４ｍｌ／只，７２ｈ判定结果。

第二份菌液加１％胰酶液，３７℃活化３０ｍｉｎ，之后按上述方法重复一次。

根据产气荚膜梭菌毒素与定型血清中和试验结果判定表（表２），判定分离到的产气荚膜梭菌的菌型。

表１产气荚膜梭菌毒素中和试验加样表（ｍｌ）

１２３４５

产气荚膜梭菌分型血清Ｂ０．２－－－－Ｃ－０．２－－－Ｄ－－０．２－－Ｅ－－－０．２－－

生理盐水－－－－０．２菌液上清液０．６０．６０．６０．６０．６总量０．８０．８０．８０．８０．８

表２产气荚膜梭菌毒素中和试验结果判定表

注射后小白鼠反应

Ｂ型抗毒素＋样品滤液＋＋＋－＋Ｃ型抗毒素＋样品滤液＋＋－－＋Ｄ型抗毒素＋样品滤液－＋－－＋Ｅ型抗毒素＋样品滤液－－－＋＋结果判定Ｃ型Ｄ型Ｂ型Ｅ型Ａ型注：“＋”表示小白鼠存活；“－”表示小白鼠死亡。

１．２．３α毒素基因的ＰＣＲ检测与核苷酸序列分析将所分离到的产气荚膜梭菌（Ｊ５）以及Ａ型、Ｂ型产气荚膜梭菌标准菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤中３７℃培养７～８ｈ，４℃，５０００ｒｐｍ离心收集菌体，洗涤后提取ＤＮＡ，将其溶于ＴＥ缓冲液中，４℃保存备用。根据α毒素基因序列文献（Ｇｅｎｂａｎｄ），应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物：

Ｐ１：５＇－ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡ－３＇，Ｐ２：５＇－ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡ－３＇，在上游引物中引入ＮｃｏＩ酶切位点，下游引物中引入ＸｈｏＩ酶切位点，由宝生物大连有限公司合成。模板经９４℃变性１ｍｉｎ，４５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，经３５个循环后琼脂糖凝胶电泳检测。ＰＣＲ产物克隆到载体ｐＥＴ２８ａ（＋）中进行序列测定（宝生物大连有限公司），应用ＤＮＡ－

畜牧兽医科学２９

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