乙酰胆碱酯酶检测有机磷

酶联免疫分析法 电化学传感器技术
研究背景

乙酰胆碱酯酶的结构：
酯解部位（丝氨酸+组氨酸） 阴离子部位 疏水性区域

水解过程
3HC
N+ H3C CH3 CH2CH2O C CH3 O
3HC
N+
CH2CH2O C
O-
+
-
:N
HO
H3C
+ N-H
CH3
CH3 O
乙酰胆碱
3HC
N+ H3C CH3 CH2CH2OH
H. Li et al. / Talanta 87 (2011) 93– 99
专利——电化学传感器相关的专利主要侧重于酶 的固定方法及纳米材料的使用。
专利名称 专利号
植物酯酶；乙酸-α-萘酯； 固蓝B盐
植物酯酶；醋酸-1-萘酯； 固蓝B盐 温敏微胶囊技术包裹胆碱 酯酶 胆碱酯酶；靛酚乙酸酯
一种快速检测果蔬中农药残留的试纸条
酸碱指示剂 (氯酚红) 荧光指示剂
标记AChE，通过反应产生的H+，引起荧光强度 或颜色的变化
比色法
1961年，Elleman法：以硫代乙酰胆碱为底物，以DTNB为显色剂。原理： DTNB与硫代胆碱中的巯基反应后生成TNB，TNB在412nm处有较强的吸收峰。 缺点：DTNB影响酶的活性。
靛酚乙酸酯
快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药 的方法 有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速 检测试纸 有机磷农药残留快速检测试剂盒
CN2013205 19833.X
CN1366065 A CN2013101 16604.8 CN2013206 68337.0
利用植物酯酶原理：酶催化乙酸-α-萘酯为乙酸和萘酯，萘酯与固蓝B盐反应 生成紫色的偶氮化合物
利用乙酰胆碱酯酶检测有机磷
有机磷的检测——常规仪器检测方法
方法 气相色谱法(GC)
高效液相色谱法 (HPLC) 气象色谱-质谱联用 法(GC-MS) 高效液相色谱-质谱 联用法(HPLC-MS) 薄层色谱法(TLC) 毛细管电泳法(CE) 超临界流体色谱法 (SFC)
优点
缺点
分离效能好，灵敏度高，分析速 不能分析沸点太高的和热不稳 度快。GB/T 17331-1998 定的农药
2硫代胆碱-2e-
AChE
硫代胆碱+乙酸
（1）
（2）
2硫代双胆碱+2H+
i1-i2 酶的抑制率（I/%）= ×100% i1
氧化电位：~+0.7 V ② 检测过氧化氢
目视检测方法
胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛 酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱酯酶 有色底物——水解为有色物质或荧光物质 有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变， 乙酰胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯 (红色)水解为乙酸和靛酚(蓝色) 由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸 酯类农药的存在。缺点：含有对酶有影响的植物次生 物质，容易产生假阳性。果蔬本底色干扰 有色探针(AuNPs)
AChE 酶稳定剂
单位：mg/kg
有色探针(AuNPs)检测有机磷的原理图：
有色探针(AuNPs)检测有机磷的结果
a. AuNPs b. AuNPs +ATI c. AuNPs +ATI +AChE d. AuNPs +ATI +methamidophos +AChE
a-f: 0, 0.02, 0.05, 0.20, 1.00, and 1.42 μg/mL methamidophos
胆碱酯酶
OC
乙酰胆碱-酶复合物
+wenku.baidu.com
-
N:
O
CH3
+
H2O
胆碱
3HC
N+ H3C CH3 CH2CH2OH
乙酰化胆碱酯酶
O
+
-
:N
HO
+
HO
C CH3
胆碱
胆碱酯酶
乙酸
电化学检测方法——电流型
① 检测电活性物质硫代胆碱：不可逆的氧化峰(硫代胆碱分子中的巯基被氧化为二硫基)
硫代乙酰胆碱 (ATCl)+H2O
应用广泛
灵敏度高
设备复杂、昂贵、制样过程繁 琐耗时
操作方便、设备简单和显色容易 高效能、高分离率、高选择性以 及分析速度快、试剂消耗少 可测定极性较强的化合物，在较 需要特殊设备 低温度下分析热不稳定的农药
快速检测方法
方法 目测法-农药速测卡和 农药残留速测箱 比色法-农药残留快速 检测仪 活体检测法 原理 胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸和靛酚(蓝色) 以碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱等为底物，以 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)为显色剂 由分子氧作用，发光菌胞内荧光酶催化，将还原态的黄素 核甘酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸， 同时释放出最大发光强度在波长450～490nm的蓝绿光。 缺点：发光菌被激活后，它的发光强度会随时间的变化而 改变，造成检测结果不稳定。检出限较高。 抗原-抗体 电流型、电位型