乳酸菌及其培养物对鸡致病性大肠杆菌的抑菌试验

中国饲料２００８年第８期

＊通讯作者

乳酸菌是机体肠道正常菌群中的优势菌，能够产生有机酸（如乳酸、乙酸、丙酸等）、双乙酰、过氧化氢等化合物，能够抑制腐败菌和病原菌。大肠杆菌在正常条件下是机体肠道的正常菌群，但在异位时或当机体抵抗力下降时又可能成为条件致

病菌，引起各种感染（凌代文，

１９９１；Ｓｏｒｒｅｌｓ和Ｓｐｅｃｋ，１９７０）。研究表明，乳酸菌通过自身的生长繁殖及其所产生的代谢物等，达到改善动物胃肠道内部微环境、降低ｐＨ值和抑制有害菌生长，对肠道细菌如大肠杆菌、沙门氏菌引起的疾病有治疗和保健作用（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ等，１９９３）。本文旨在通过乳酸菌的体外抑菌试验，探讨乳酸菌菌液及其代谢产物对致病性大肠杆菌的抑制特性。１材料与方法

１．１试验菌株及培养条件乳酸杆菌为乳酪杆菌，鸡致病性大肠杆菌为鸡志贺氏大肠杆菌。培养乳酸菌专性培养液（ＭＲＳ）组成为：胰蛋白胨１０ｇ，牛肉蛋白胨１０ｇ，酵母浸出物５ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温（８０）１ｍＬ，磷酸氢二钾２ｇ，乙酸钠５ｇ，柠檬酸钠２ｇ，硫酸镁２００ｍｇ，硫酸锰５０ｍｇ，定容至

１Ｌ，ｐＨ为６．２～６．６。培养条件为３７℃，厌氧静止

培养１８～２４ｈ。ＬＢ培养基的组成为：胰蛋白胨１０ｇ，酵母浸出物５ｇ，氯化钠１０ｇ，定容至１Ｌ，ｐＨ为７．０。培养条件为３７℃，摇床培养（１５０ｒ／

ｍｉｎ）

１８～２４ｈ。１．２根据抑菌环直径大小判定抑菌能力的强弱１．２．１乳酸杆菌菌液的制备取０．１ｍＬ乳酸菌接种在２００ｍＬＭＲＳ液体培养基中，３７℃厌氧培养２４ｈ，然后进行抑菌试验。

１．２．２乳酸杆菌代谢产物的制备将上述各时间段培养的乳酸菌菌液取出３ｍＬ，然后以１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液用滤菌膜过滤，即为乳酸杆菌代谢产物。

１．２．３营养琼脂培养基的准备称量２ｇ酵母、１ｇ氯化钠、１ｇ胰蛋白胨、４ｇ琼脂，置于２５０ｍＬ的三角瓶中，再加入２００ｍＬ蒸馏水配制成溶液，高压灭菌。之后将灭菌过的营养琼脂液倒入１２个平皿中，待用。

１．２．４对大肠杆菌的抑菌试验取２００μＬ大肠杆菌培养物，用无菌的Ｌ型玻璃棒将其均匀抹在营养琼脂培养基上，待干后打孔。在平皿底部分区（分四个区），用金属管在每个区打３个孔，孔径为

乳酸菌及其培养物对鸡致病性大肠杆菌的抑菌试验

郑州牧业高等专科学校郭金玲

河南农业大学牧医工程学院郑秋红刘香尹清强＊

商丘市饲料监测站

董良奇

［摘要］本试验研究了乳酸菌、乳酸菌上清液、抗生素及ＭＲＳ对照液对鸡致病性大肠杆菌的体外抑菌作用。结果表明，乳酸杆菌菌液及培养后的无菌上清液都有较强的抑菌活性，其抑菌圈的直径显著大于对照组（Ｐ＜０．０５）；且随着乳酸菌培养时间的不同，乳酸菌培养液的ｐＨ值逐渐降低，对致病性大肠杆菌的抑制作用也逐渐增强。

［关键词］乳酸菌；鸡致病性大肠杆菌；体外抑菌试验［中图分类号］Ｓ８１６．７

［文献标识码］Ａ

［文章编号］１００４－３３１４（２００８）０８－００３４－０３

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｎａｎｔ，

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｎｄＭＲＳｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃＥ．ｃｏｌｉｏｆｃｈｉｃｋｅｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃＥ．ｃｏｌｉ．ＴｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｚｏｎｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗｅｒｅｌａｒｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ；

ｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｓａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＥ．ｃｏｌｉｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｎｇｔｉｍｅ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；

ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃＥ．ｃｏｌｉｏｆｃｈｉｃｋｅｎ；ｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＥ．ｃｏｌｉｉｎｖｉｔｒｏ３４

中国饲料

２００８年第８期（下转第４０页）

培养时间０ｈ６ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ大肠杆菌＋乳酸菌

５．０２５．１６５．６９５．８３５．８４乳酸菌

４．９６４．９１４．９０４．８１４．８１大肠杆菌＋乳酸菌上清液

５．１１５．０３４．８５４．８３４．８３大肠杆菌

７．３６

８．２４

８．９０

９．０５

８．８９

注：同列数据肩标不含相同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），含相同字母或无字母标注表示

差异不显著（Ｐ＞０．０５）；下同。

乳酸菌原液８．１±１．０８．２±０．６９．９±０．７８．０±０．９８．６±０．９ａ乳酸菌上清液７．３±０．４７．９±０．９８．７±０．５８．５±０．８８．１±０．６ａ抗生素８．５±０．５８．９±０．７９．４±０．２１０．７±１．０９．４±１．０ｂＭＲＳ对照液７．２±０．１７．７±０．６７．４±０．２７．４±０．４７．４±０．２ａ

１２ｈ

２４ｈ

４８ｈ

７２ｈ

培养时间

平均数

表１乳酸菌及其上清液、抗生素、ＭＲＳ对照液对大

肠杆菌所产生的抑菌圈的大小（ｎ＝３）ｍｍ

图１不同培养时间段的光密度值

培养时间０ｈ２４ｈ４８ｈ大肠杆菌＋乳酸菌（３．７１±０．４５）×１０７ａ（５．６５±０．７６）×１０４ａｂ（１．１７±０．２３）×１０３ａ乳酸菌（１．２５±０．２１）×１０４ｂ（８．３３±０．８４）×１０３ａ（３．１７±０．４１）×１０３ａ大肠杆菌＋乳酸菌上清液

（３．６３±０．４４）×１０７ａ（１．４７±０．３５）×１０５ｂ（８．３３±０．９０）×１０３ａ大肠杆菌

（８．７１±０．９２）×１０７ａ

（１．４１±０．２５）×１０８ｃ

（１．８８±０．３１）×１０９ｂ

表２不同时间段培养液的活菌数变化

个／ｍＬ

大肠杆菌＋乳酸菌

乳酸菌

大肠杆菌＋上清液大肠杆菌

８７６

５４３２１０ＯＤ值

０

６

２４

４８

７２

时间（ｈ）

表３不同时间段培养液的ｐＨ值变化

７．０ｍｍ，再用镊子将孔内琼脂块挑出，然后封底。在４个区的孔内分别加入乳酸菌原液、乳酸菌上清液、抗生素、ＭＲＳ对照液。３７℃培养１６ｈ，观察抑菌圈大小并用游标卡尺测量其直径，根据抑菌圈直径大小作为判定其抑菌能力的强弱。

１．３利用液体培养的方法测定抑菌能力的大小制取４个５０ｍＬＬＢ液体培养基，标号１、２、３、４。１号管加入１ｍＬ乳酸菌和２００μＬ致病性大肠杆菌，２号管加入１ｍＬ乳酸菌和２００μＬ无菌蒸馏水，３号管加入１ｍＬ乳酸菌上清液和２００μＬ致病性大肠杆菌，４号管加入２００μＬ致病性大肠杆菌和１ｍＬ无菌蒸馏水。

随即取样测量光密度值、菌数及ｐＨ值，再置３７℃厌氧培养６、２４、４８、７２ｈ，测定各不同时间段的活菌数、光密度值（ＯＤ值）、ｐＨ值。

１．４统计分析数据经Ｅｘｃｅｌ软件初步整理后，利用ＳＰＳＳ１０．０单因子方差分析中ＬＳＤ法进行统计分析。

２结果与讨论

２．１乳酸菌原液、乳酸菌原液上清液、抗生素、ＭＲＳ对照液对致病性大肠杆菌的抑制作用见表１。表１表明，

乳酸菌原液、乳酸菌原液上清液和抗生素对致病性大肠杆菌都有一定的抑制作用，其中以抗生素的抑制效果最好。２．２不同时间段的活菌数、光密度值、ｐＨ值变化

见表２、图１和表３。由表２可知，培养液中的活菌数随着培养时间的增加变化显著，大肠杆菌＋乳酸菌、乳酸菌、大肠杆菌＋乳酸菌上清液处理组的活菌数，随培养时间的延长不断减少；而只含有大肠杆菌的处理组的活菌数不断增加，这说明乳酸杆菌及其上清液对致病性大肠杆菌有明显的抑制作用。

从图１可知，不同时间段培养液的ＯＤ值变

化趋势虽然是相同的，但２４ｈ后只含有大肠杆菌

的ＯＤ值大于其他各组。这说明大肠杆菌在没有加抑制剂的情况下，其生长速度比添加有抑制剂的快。也就是说，乳酸菌原液及上清液、抗生素对致病性大肠杆菌有明显的抑菌作用。

从表３可知，

大肠杆菌＋乳酸菌、乳酸菌、大肠杆菌＋乳酸菌上清液处理组的ｐＨ值，随培养时间的延长变化幅度不大，但与只含有大肠杆菌的处理组相比仍显得很低，这一结果与大肠杆菌的活菌数低相一致。这说明乳酸菌对致病性大肠杆菌的抑菌作用可能与乳酸菌产酸有关。

３

讨论

本试验结果表明，乳酸菌原液及乳酸菌原液

上清液具有与抗生素同样的抑菌作用。从抑菌圈的大小来看，乳酸菌原液和乳酸菌原液上清液的抑菌作用低于抗生素。另外，乳酸菌原液和乳酸菌原液的上清液抑菌作用无显著差异，说明乳酸菌的抑制作用有可能与其在培养过程中产生的代谢产物（乙酸、乳酸、丙酸等）密切相关。培养液中低

３５