蛋白质组学概论及数据分析

(1007.4251) (1183.5266) (2098.8909) (538.2296) (2171.9338) (2689.1398) (3263.2997)
大气压化学电离
表面增强激光解吸电离
Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI
Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization, SELDI
质量分析器
磁质量分析器 飞行时间质谱仪 (Magnetic Sector Analyzer) (time of flight, TOF)
蛋白质组研究中的样品分离 凝胶电泳（1D gel、2-DE)
色谱技术（液相色谱、毛细管电泳）
6
1D Gel
7
1D Gel
• Strengths:
• Limitations:
• Simple
• Limited resolution • Inexpensive sample prep • Low MW Proteins • Membrane proteins (<7kDa) • High MW proteins (>100 kDa) • Not Quantitative
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DIGE
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多维色谱
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多维色谱
• Strengths:
• Reduces sample complexity • Low abundance proteins • Membrane proteins • All MW Proteins • Flexible (different column combinations) • Can automate
4. 与分析鉴定方法相匹配
电泳后样品可以转移到PVDF膜上进行N或C端的序列分析 直接进行蛋白质胶内或膜上酶解与质谱分析匹配。
2-DE的缺点
极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极 大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质 用此种技术难于有效分离。
胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱联 用实现自动化。
2DE
450.2017 (B-1) 1740.7500 (B-2) 1407.6462 (B-3) 1300.5116 (B-4)
1526.6211 (C-1) 664.3300 (C-2) 1593.7101 (C-3) 1114.4416 (C-4)
实验 (MALDI) Spectrum
1007 1199
2 Unknown masses 1 hit on B
3 hits on A
Conclude the query
protein is A
基于PMF鉴定蛋白质
• 实验质谱图谱 • 蛋白酶或酶切位点 • 已知蛋白质数据库 • 修饰位点及基团质量
• 图谱匹配质量判断
• 质量误差阈值(100 ppm = 1000.0 ± 0.1 Da) • 常用软件(Prowl, ProFound, Mascot, PepIdent) • 预测蛋白pI和质量，预判蛋白在胶内位置
acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe
acek dfhsadfgeasdfpk ivtmeeewenk dadnfeqwfe acedfhsadfgek asdfpk ivtmeeewendak dnfegwfe
1007.4251 (A-1) 1112.4894 (A-2) 2098.8909 (A-3) 538.2296 (A-4)
离子源
电子轰击电离
化学离子化 场电离 场解吸 快原子轰击 基质辅助激光解析电离 电喷雾电离
Electron Impact Ionization, EI
Chemical Ionization, CI
Field Ionization FD
Field Desorption FD Fast Atom Bombardment, FAB Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI Electrospray Ionization, ESI
四极质量分析器
离子阱
(quadrupole mass analyzer)
(ion trap) cyclotron resonance, FT-ICR)
傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 (Fourier transform ion
质谱仪的主要技术指标
质量范围： 质谱仪所检测的单电荷离子的质荷比范围
分辨率(R)： 质谱仪分开相邻两离子质量的能力。 R = m / m m为质谱仪可分辨的相邻两峰的质量差 m为可分辨的相邻两峰的平均质量
Abundance
450
538
2098
698
mΒιβλιοθήκη Baiduz
实验谱图 vs. 理论谱图
Query Masses Database Mass List Results
450.2201 538.2296 698.3100
1007.5391
1199.4916 2098.9909
450.2017 (B) 538.2296 (A) 664.3300 (C) 1007.4251 (A) 1112.4894 (A) 1114.4416 (C) 1300.5116 (B) 1407.6462 (B) 1526.6211 (C) 1593.7101 (C) 1740.7501 (B) 2098.8909 (A)
研究蛋白质组的科学
蛋白质组学
•Cataloguing Proteomics • Protein catalogue--what proteins are there in a cell, tissue, organelle, etc.
•Expression proteomics: • analysis of differential protein expression •Functional proteomics: • posttranslational modifications • protein-protein, protein-ligand interactions • sequence-structure-function relationships
acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe
(1007.4251) (1183.5266) (2098.8909) (538.2296)
Tryptic Fragments (1 missed cleavage)
acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe acedfhsakdfgeasdfpk ivtmeeewendadnfekgwfe dfgeasdfpkivtmeeewendadnfek
• Limitations:
• Complex setup • No faster than 2D gels • Computer intensive • Not Quantitative • Reproducibility
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Proteomics Workflow
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质谱仪器的组成
数据及供电系统 ┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓ 进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 ┗━━━━━╋━━━━━━┛ 真空系统
4842.05
4842.05
4842.05
构建理论上PMF数据库
Sequence DB Calc. Tryptic Frags Mass List
>Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe >Protein B acekdfhsadfqea sdfpkivtmeeewe nkdadnfeqwfe >Protein C acedfhsadfqeka sdfpkivtmeeewe ndakdnfeqwfe
3
蛋白质组研究中的样品制备
• 细胞或组织中的全蛋白质组分 • 样品预分级---------将细胞或组织中的 全体蛋白质分成不同部分，分别进行 研究。
样品预分级的主要方法
• 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 • 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 • 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等 样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量 和检测灵敏度。
蛋白质组学概论及数据分析
1
蛋白质组和蛋白质组学
蛋白质组（PROTEOME）
1994年由Williams和Wilkins提出: The entire PROTEin
population expressed by a genOME or by a cell or tissue type
蛋白质组学（proteomics）
Challenge 1: 质量非唯一性
Gly + Gly = 114.043 Ala + Gly = 128.059 -> Asn = 114.043 -> Gln = 128.059 -> Lys = 128.095 Gly + Val = 156.090 -> Arg = 156.101
Ala + Asp = Glu + Gly = 186.064
质量精确度： 生物分析物质量的测量值与实际分子量的接近程度
(用百万分率表示，ppm)
扫描速度:
离子检测速度即质谱仪获取数据的速度
质谱能够告诉我们什么?
蛋白的组成
蛋白的表达水平 蛋白的翻译后修饰
proteomics
蛋白的相互作用
蛋白的功能
基于质谱的蛋白质组学实验流程
质谱测定蛋白质序列方法
肽质量指纹谱法 (PMF) Peptide Mass Fingerprint 肽段碎片离子鉴定法 (PFI) Peptide Fragment Identification 从头测序法
PMF如何产生
Sequence Mass (M+H) Mass Spectrum
>Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe
>Protein B acekdfhsadfqea sdfpkivtmeeewe nkdadnfeqwfe >Protein C acedfhsadfqeka sdfpkivtmeeewe ndakdnfeqwfe
Ser + Val = 186.100
-> Trp = 186.079
-> Trp = 186.079 u
Leu = Ile = 113.084
Challenge 2: 酶切不完全
Sequence Tryptic Fragments (no missed cleavage)
>Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe
2-DE
• First dimension: isoelectric point (isoelectric focusing) • Second dimension: molecular weight (SDS gel electrophoresis)
9
双向凝胶电泳的基本步骤
1、样品制备（溶解、变性、还原、去除杂质）
4842.05
acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe
acek dfhsadfgeasdfpk ivtmeeewenk dadnfeqwfe acedfhsadfgek asdfpk ivtmeeewendak dnfegwfe
4842.05
4842.05
de novo
PMF如何产生
Sequence Mass (M+H) Tryptic Fragments
>Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe
>Protein B acekdfhsadfqea sdfpkivtmeeewe nkdadnfeqwfe >Protein C acedfhsadfqeka sdfpkivtmeeewe ndakdnfeqwfe
2、第一相等点聚焦 3、第二相SDS-PAGE 4、蛋白质的检测 5、图谱数据化分析
2DE的优点
1. 一次可分离上千种10～100 kD分子量的蛋白质
2. 高灵敏度和高分辨率
3. 便于计算机分析处理 可进行蛋白质定位、等电点、分子量的鉴定以及蛋白质 的定量；可建立蛋白质数据库；不同的图谱可进行比较和 分析