双磷酸盐类药物的研究进展-王杰军教授
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•破骨细胞
•H
•蛋白水解酶
+
•成骨细胞
•占据吸收空洞
•合成
•溶解的骨盐
•消化的有机 质
•骨基质 •钙盐沉积
•钙盐沉积的骨
•
•
•双磷酸盐的作用机制
•与磷灰石相结合
•选择性聚积在破骨细胞周围 •有过量骨质溶解时局部释放
•破骨细胞活性
•抑制分化成熟 •抑制在骨表面粘附 •酸产生减少 •酶活性降低 •异戊烯化降低
上市国 家 美国
芬兰
瑞士
美国
德国
瑞士
国内上市时 间
1996年
1988年
1996年
1998年
目前代表 生产厂家
依膦 邦得林
骨膦 固令
阿可达 博宁
福善美
江苏正大天晴药业 成都制药厂
德国先灵制药 南京制药
诺华制药 深圳海王制药
默沙东制药
2001年
2004年
艾本
天晴依 泰
河北医科大学生物工程中 心
江苏正大天晴药业
•92 %
•60 %
•22 %
•8% •1%
•Ref:Adapted with permission from Dunford JE, et al. J Pharmacol Exp Ther. 2000;296:235-242. •
含氮双磷酸盐抑制兔破骨细胞蛋白异戊烯多转酶
•Ctrl Clod Etid Pam •
•O
•氯屈磷酸钠
•（一代）
•
•O •HO P ONa •H2NCH2 C OH •HO P ONa
•O
•帕米磷酸二钠
•（二代）
•
•伊班磷酸钠
（三代）
•O
•HO P ONa •CH3(CH2)4NCH2CH2 C OHH2O
•CH2 HO P OH •O
•
•唑来膦酸
• 最新一代、强效双磷酸盐1,2 • 杂环中含氮的双磷酸盐，组
•含氮双磷酸盐抑制鸟苷三磷酸 结合蛋白的异丙烯化，此过程是 破骨细胞形成、发挥活性和存活 所必需的。
• Farnesyl diphosphate •
•Ras •S
• Geranylgeranyl diphosphate
•Rho •S
•
对0.1 µM 双磷酸盐处理的J774细胞 抑制法尼基二磷酸盐合成酶活性
•
•筛查理想的双膦酸盐药物
• 在新的药物学模型中筛查出300种双膦酸盐类似物 • 目标：
–新的化学结构 –抗骨吸收能力更强 –骨盐沉着作用降低 –肾脏和胃肠耐受性好 –生物利用度提高
•
骨破坏的机理
•
•骨细胞生理学
•成骨细胞
•内衬细胞
•破骨细胞
•类骨质 •矿化骨
•
•骨细胞生理学
破骨细胞前体
•增殖 •活化
•70 kD •60 kD
Zol Til 100 µM 40 hr
•26 kD •21 kD
•17 kD
•Ref:Coxon et al. J Bone Miner Res. 2000;15:1467-1476. •
含氮双磷酸盐激活兔破骨细胞中Caspase-3样蛋白酶
•1,000
•800
•Caspase活性/对照% •平均值 ± 标准差
双磷酸盐类药物的研究 进展-王杰军教授
2020年5月24日星期日
双磷酸盐药物的分类与进展
通用名
依替膦酸钠 (Etidronate) 氯屈膦酸钠 Clodronate 帕米膦酸二钠 Pamidronate 阿伦膦酸钠 Alendrinate 伊班膦酸钠 Ibandronate
唑来膦酸 Zoledronate
•
•双 膦 酸 盐 分 类
•含氨基
• Alendrinate 、Ibandronate•
•
•
抑制
•
• •
GTP结合蛋白 转录后的修饰
•
•
•
破骨细胞活性丧失 •
•不含氨基 Clodronate
细胞内 代谢形成
β – γ 亚甲蓝
累积
•
破骨细胞调亡 •
破骨细胞活性降低
•
•O •HO P OH •Cl C Cl •HO P OH
•破骨细胞数量
•促使细胞凋亡 •细胞骨架改变 •产生细胞毒产物-ATP类似物
•
•双磷酸盐的作用机制
•抑制破骨细胞形成、分化成熟 •和活性，促进其凋亡
•调制成骨细胞和破骨细胞之 间信号传递
•骨吸收过程中局部释放
•浓集在新矿化的骨质和破 骨细胞下
•
含氮双磷酸盐作用的分子机制
•HMG-CoA •Mevalonate • Geranyl diphosphate
•凋亡中的破骨细胞
• 细胞凋亡
• 细胞质浓缩 • 细胞核碎裂 • 空泡形成
•
双膦酸盐的抗癌作用
•
唑来膦酸临床前期的抗肿瘤效应
– 在体外抑制各种人肿瘤细胞株的增殖和降低其 存活能力
– 在体外诱导各种人肿瘤细胞株的凋亡 – 在体外抑制人乳腺癌细胞侵入细胞外基质 – 在体外抑制人内皮细胞增殖 – 在体内抑制血管形成 – 与抗癌药物具有强的协同作用
•
•细胞存活能力，比对照 %
唑来膦酸减少 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞存活能力
•双磷酸盐浓度, mM
•Ref:Adapted with permission from Senaratne SG, et al. Br J Cancer. 2000;82:1459-1468. © 2000 Cancer Research Campaign.
唑来膦酸减少人乳腺癌细胞对裸鼠的骨损害
•4
•放射图像检查损伤区域, mm2
•3
•2
•1
•0 •不治疗
•Zol •1 µg
•Iba •1 µg
•每只小鼠剂量/天
•Ref:Green JR, et al. Ann Oncol. 2000;11(suppl 4):14.
•
•Ale •10 µg
唑来膦酸抑制人脐静脉内皮细胞增殖
•
•双膦酸盐在体内作用强度的比较
•体外相对抑制强度（小鼠颅盖骨培养）
•Zoledronic Acid
•103
•102
•Ibandronate •Risedronate
•Olpadronate
•Alendronate
•Clodronate
•101
•Etidronate
•100
•Pamidronate •Neridronate
•
正在进行的唑来膦酸抗肿瘤活性研究
–体外与抗肿瘤药物的协同研究 –对裸鼠模型中骨和软组织转移的抑制活性研
究 –对肿瘤多药耐药的逆转研究 -对诱导细胞凋亡机制中的分子定位研究
•
前景
•目前进行中的临床前研究包括： –在动物模型的抗肿瘤作用
• 骨转移 • 内脏软组织转移 • 原发肿瘤 –对与骨转移有关的疼痛的作用 –与免疫系统组分（例如细胞因子、生长因 子、/ T细胞）的相互作用
•900 •800 •700 •600 •500 •400 •300 •200 •100
•0
•0.05
•clo
•1.00
•pam
•2.77
•olp
•7.44
•ale
•847
•35.90
•43.Leabharlann Baidu0
•ris
•iba
•zol
•Ref1: Green JR, Müller K, Jaeggi KA. Preclinical pharmacology of CGP 42'446, a new, potent, heterocyclic bisphosphonate compound. J Bone Miner Res. 1994;9:745-751.
•
唑来膦酸与Paclitaxel 诱导乳腺癌细胞凋亡的 协同作用
•800
•凋亡细胞, 比对照%
•600
•400
•200
•0 •对照
•Zol • 10 µM
•Paclitaxel •Zol+ paclitaxel •2 nM
•Ref:Jagdev SP, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract 2•619.
•r = 0.97
•100 •101 •102 •103 •104 •105 •体内相对抑制强度，高钙血症小鼠
•Green JR, et al. J Bone Miner Res. 1994;9:745-751. •
•106
•双膦酸盐的相对抑制强度1
•体内相对于PAm的强度线性标度 •高钙血症大鼠
•600
•400
•200
•0
•对照
•Zol
•Ris
•Ale
•Pam
•Ref:Benford HL, et al. Calcif Tiss Int. 1999;64(suppl 1):S45. Abstract 0-33. •
含氮双磷酸盐促进破骨细胞凋亡
•未凋亡的破骨细胞
•双磷酸盐
• Caspase 激活
•150
•*bFGF-诱导的
•*
•抑制, 占对照%
•100 •50
•Zol •EDTA
•* •*
•* •*
•0
•
1
3
10
•浓度, µM
•bFGF = Basic fibroblast growth factor; EDTA = Ethylenediamine-tetraacetic acid. Wood J, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract 2620.
成： –一个双磷酸盐骨架结构 –引入含氮咪唑环、在关
键位上含有2个氮原子
•Ref1. Green JR, Müller K, Jaeggi KA. Preclinical pharmacology of CGP 42'446, a new, potent, heterocyclic bisphosphonate compound. J Bone Miner Res. 1994;9:745-751. •Ref2. Green JR, Seltenmeyer Y, Jaeggi KA, Widler L. Renal tolerability profile of novel, potent bisphosphonates in two short-term rat models. Pharmacol Toxicol. 1997;80:225230.
•
•* 30
唑来膦酸：抗肿瘤潜能
•对小鼠生长因子预埋模型，低剂量的唑来膦酸抑制血管形成*
bFGF-诱导的血管形成抑制率 %
•100
•血含量 •组织湿重
•75
•50
•25
•0 •1
•10
•100
•Zol, µg/kg SC
•* Wood J, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract 2620.
•
•
唑来膦酸降低肿瘤细胞存活能力 但对正常成纤维细胞无影响
•MDA-MB-231 乳腺癌细胞 •125
正常 3T3 成纤维细胞
•细胞存活能力，比对照 %
•100
•75
•50
•25
•0
•10
•50
•zlo 浓度, µM
•Ref:Ref:Senaratne SG, et al. Br J Cancer. 2000;82:1459-1468. •
•100
唑来膦酸诱导人Hs-578t 乳腺癌细胞凋亡
•100 •75
•Zol •Pam
•DNA碎片, 比对照%
•50
•25
•0 •0
•10
•50
•双磷酸盐浓度, µM
•100
•Ref:Adapted with permission from Senaratne SG, et al. Br J Cancer. 2000;82:1459-1468. © 2000 Cancer Research Campaingn.
唑来膦酸和Tamoxifen诱导乳腺癌细胞凋亡 的协同作用
•800 •600
•对照 •Tam •Zol •Zol + Tam
•400
•凋亡细胞, 占总细胞数%
•200
•0
•Tam: 0 •Zol: 0
0.01 0.1
0
0.01 0.1 µM
0
0
100 100 100 µM
•Ref:Jagdev SP, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract•2619.
•
•几种双膦酸盐作用强度比较
双磷酸盐
抗骨吸收能力
Etidronate Clodronate Pamidronate Risedronate Alendronate Ibandronate
1 10 100 5,000-10,000 1,000 10,000
Zoledronate
20,000
•Ref1:Fleisch H.Bisphonates:Pharmacology and use in the treatment of tumor-induced •hypercalcaemia and metastatic bone disease.Drugs,199:,42:919
•H
•蛋白水解酶
+
•成骨细胞
•占据吸收空洞
•合成
•溶解的骨盐
•消化的有机 质
•骨基质 •钙盐沉积
•钙盐沉积的骨
•
•
•双磷酸盐的作用机制
•与磷灰石相结合
•选择性聚积在破骨细胞周围 •有过量骨质溶解时局部释放
•破骨细胞活性
•抑制分化成熟 •抑制在骨表面粘附 •酸产生减少 •酶活性降低 •异戊烯化降低
上市国 家 美国
芬兰
瑞士
美国
德国
瑞士
国内上市时 间
1996年
1988年
1996年
1998年
目前代表 生产厂家
依膦 邦得林
骨膦 固令
阿可达 博宁
福善美
江苏正大天晴药业 成都制药厂
德国先灵制药 南京制药
诺华制药 深圳海王制药
默沙东制药
2001年
2004年
艾本
天晴依 泰
河北医科大学生物工程中 心
江苏正大天晴药业
•92 %
•60 %
•22 %
•8% •1%
•Ref:Adapted with permission from Dunford JE, et al. J Pharmacol Exp Ther. 2000;296:235-242. •
含氮双磷酸盐抑制兔破骨细胞蛋白异戊烯多转酶
•Ctrl Clod Etid Pam •
•O
•氯屈磷酸钠
•（一代）
•
•O •HO P ONa •H2NCH2 C OH •HO P ONa
•O
•帕米磷酸二钠
•（二代）
•
•伊班磷酸钠
（三代）
•O
•HO P ONa •CH3(CH2)4NCH2CH2 C OHH2O
•CH2 HO P OH •O
•
•唑来膦酸
• 最新一代、强效双磷酸盐1,2 • 杂环中含氮的双磷酸盐，组
•含氮双磷酸盐抑制鸟苷三磷酸 结合蛋白的异丙烯化，此过程是 破骨细胞形成、发挥活性和存活 所必需的。
• Farnesyl diphosphate •
•Ras •S
• Geranylgeranyl diphosphate
•Rho •S
•
对0.1 µM 双磷酸盐处理的J774细胞 抑制法尼基二磷酸盐合成酶活性
•
•筛查理想的双膦酸盐药物
• 在新的药物学模型中筛查出300种双膦酸盐类似物 • 目标：
–新的化学结构 –抗骨吸收能力更强 –骨盐沉着作用降低 –肾脏和胃肠耐受性好 –生物利用度提高
•
骨破坏的机理
•
•骨细胞生理学
•成骨细胞
•内衬细胞
•破骨细胞
•类骨质 •矿化骨
•
•骨细胞生理学
破骨细胞前体
•增殖 •活化
•70 kD •60 kD
Zol Til 100 µM 40 hr
•26 kD •21 kD
•17 kD
•Ref:Coxon et al. J Bone Miner Res. 2000;15:1467-1476. •
含氮双磷酸盐激活兔破骨细胞中Caspase-3样蛋白酶
•1,000
•800
•Caspase活性/对照% •平均值 ± 标准差
双磷酸盐类药物的研究 进展-王杰军教授
2020年5月24日星期日
双磷酸盐药物的分类与进展
通用名
依替膦酸钠 (Etidronate) 氯屈膦酸钠 Clodronate 帕米膦酸二钠 Pamidronate 阿伦膦酸钠 Alendrinate 伊班膦酸钠 Ibandronate
唑来膦酸 Zoledronate
•
•双 膦 酸 盐 分 类
•含氨基
• Alendrinate 、Ibandronate•
•
•
抑制
•
• •
GTP结合蛋白 转录后的修饰
•
•
•
破骨细胞活性丧失 •
•不含氨基 Clodronate
细胞内 代谢形成
β – γ 亚甲蓝
累积
•
破骨细胞调亡 •
破骨细胞活性降低
•
•O •HO P OH •Cl C Cl •HO P OH
•破骨细胞数量
•促使细胞凋亡 •细胞骨架改变 •产生细胞毒产物-ATP类似物
•
•双磷酸盐的作用机制
•抑制破骨细胞形成、分化成熟 •和活性，促进其凋亡
•调制成骨细胞和破骨细胞之 间信号传递
•骨吸收过程中局部释放
•浓集在新矿化的骨质和破 骨细胞下
•
含氮双磷酸盐作用的分子机制
•HMG-CoA •Mevalonate • Geranyl diphosphate
•凋亡中的破骨细胞
• 细胞凋亡
• 细胞质浓缩 • 细胞核碎裂 • 空泡形成
•
双膦酸盐的抗癌作用
•
唑来膦酸临床前期的抗肿瘤效应
– 在体外抑制各种人肿瘤细胞株的增殖和降低其 存活能力
– 在体外诱导各种人肿瘤细胞株的凋亡 – 在体外抑制人乳腺癌细胞侵入细胞外基质 – 在体外抑制人内皮细胞增殖 – 在体内抑制血管形成 – 与抗癌药物具有强的协同作用
•
•细胞存活能力，比对照 %
唑来膦酸减少 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞存活能力
•双磷酸盐浓度, mM
•Ref:Adapted with permission from Senaratne SG, et al. Br J Cancer. 2000;82:1459-1468. © 2000 Cancer Research Campaign.
唑来膦酸减少人乳腺癌细胞对裸鼠的骨损害
•4
•放射图像检查损伤区域, mm2
•3
•2
•1
•0 •不治疗
•Zol •1 µg
•Iba •1 µg
•每只小鼠剂量/天
•Ref:Green JR, et al. Ann Oncol. 2000;11(suppl 4):14.
•
•Ale •10 µg
唑来膦酸抑制人脐静脉内皮细胞增殖
•
•双膦酸盐在体内作用强度的比较
•体外相对抑制强度（小鼠颅盖骨培养）
•Zoledronic Acid
•103
•102
•Ibandronate •Risedronate
•Olpadronate
•Alendronate
•Clodronate
•101
•Etidronate
•100
•Pamidronate •Neridronate
•
正在进行的唑来膦酸抗肿瘤活性研究
–体外与抗肿瘤药物的协同研究 –对裸鼠模型中骨和软组织转移的抑制活性研
究 –对肿瘤多药耐药的逆转研究 -对诱导细胞凋亡机制中的分子定位研究
•
前景
•目前进行中的临床前研究包括： –在动物模型的抗肿瘤作用
• 骨转移 • 内脏软组织转移 • 原发肿瘤 –对与骨转移有关的疼痛的作用 –与免疫系统组分（例如细胞因子、生长因 子、/ T细胞）的相互作用
•900 •800 •700 •600 •500 •400 •300 •200 •100
•0
•0.05
•clo
•1.00
•pam
•2.77
•olp
•7.44
•ale
•847
•35.90
•43.Leabharlann Baidu0
•ris
•iba
•zol
•Ref1: Green JR, Müller K, Jaeggi KA. Preclinical pharmacology of CGP 42'446, a new, potent, heterocyclic bisphosphonate compound. J Bone Miner Res. 1994;9:745-751.
•
唑来膦酸与Paclitaxel 诱导乳腺癌细胞凋亡的 协同作用
•800
•凋亡细胞, 比对照%
•600
•400
•200
•0 •对照
•Zol • 10 µM
•Paclitaxel •Zol+ paclitaxel •2 nM
•Ref:Jagdev SP, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract 2•619.
•r = 0.97
•100 •101 •102 •103 •104 •105 •体内相对抑制强度，高钙血症小鼠
•Green JR, et al. J Bone Miner Res. 1994;9:745-751. •
•106
•双膦酸盐的相对抑制强度1
•体内相对于PAm的强度线性标度 •高钙血症大鼠
•600
•400
•200
•0
•对照
•Zol
•Ris
•Ale
•Pam
•Ref:Benford HL, et al. Calcif Tiss Int. 1999;64(suppl 1):S45. Abstract 0-33. •
含氮双磷酸盐促进破骨细胞凋亡
•未凋亡的破骨细胞
•双磷酸盐
• Caspase 激活
•150
•*bFGF-诱导的
•*
•抑制, 占对照%
•100 •50
•Zol •EDTA
•* •*
•* •*
•0
•
1
3
10
•浓度, µM
•bFGF = Basic fibroblast growth factor; EDTA = Ethylenediamine-tetraacetic acid. Wood J, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract 2620.
成： –一个双磷酸盐骨架结构 –引入含氮咪唑环、在关
键位上含有2个氮原子
•Ref1. Green JR, Müller K, Jaeggi KA. Preclinical pharmacology of CGP 42'446, a new, potent, heterocyclic bisphosphonate compound. J Bone Miner Res. 1994;9:745-751. •Ref2. Green JR, Seltenmeyer Y, Jaeggi KA, Widler L. Renal tolerability profile of novel, potent bisphosphonates in two short-term rat models. Pharmacol Toxicol. 1997;80:225230.
•
•* 30
唑来膦酸：抗肿瘤潜能
•对小鼠生长因子预埋模型，低剂量的唑来膦酸抑制血管形成*
bFGF-诱导的血管形成抑制率 %
•100
•血含量 •组织湿重
•75
•50
•25
•0 •1
•10
•100
•Zol, µg/kg SC
•* Wood J, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract 2620.
•
•
唑来膦酸降低肿瘤细胞存活能力 但对正常成纤维细胞无影响
•MDA-MB-231 乳腺癌细胞 •125
正常 3T3 成纤维细胞
•细胞存活能力，比对照 %
•100
•75
•50
•25
•0
•10
•50
•zlo 浓度, µM
•Ref:Ref:Senaratne SG, et al. Br J Cancer. 2000;82:1459-1468. •
•100
唑来膦酸诱导人Hs-578t 乳腺癌细胞凋亡
•100 •75
•Zol •Pam
•DNA碎片, 比对照%
•50
•25
•0 •0
•10
•50
•双磷酸盐浓度, µM
•100
•Ref:Adapted with permission from Senaratne SG, et al. Br J Cancer. 2000;82:1459-1468. © 2000 Cancer Research Campaingn.
唑来膦酸和Tamoxifen诱导乳腺癌细胞凋亡 的协同作用
•800 •600
•对照 •Tam •Zol •Zol + Tam
•400
•凋亡细胞, 占总细胞数%
•200
•0
•Tam: 0 •Zol: 0
0.01 0.1
0
0.01 0.1 µM
0
0
100 100 100 µM
•Ref:Jagdev SP, et al. Proc Am Soc Clin Oncol. 2000;19:664a. Abstract•2619.
•
•几种双膦酸盐作用强度比较
双磷酸盐
抗骨吸收能力
Etidronate Clodronate Pamidronate Risedronate Alendronate Ibandronate
1 10 100 5,000-10,000 1,000 10,000
Zoledronate
20,000
•Ref1:Fleisch H.Bisphonates:Pharmacology and use in the treatment of tumor-induced •hypercalcaemia and metastatic bone disease.Drugs,199:,42:919