腺病毒分型与诊断方法研究进展
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４集成检测——包括腺病毒在内的多种呼吸道病原因子的 检测
常见的呼吸道感染病毒性病原因子包括腺病毒、流感病
万方数据
·３９３·
毒Ａ和Ｂ、副流感病毒１、２和３以及呼吸道合胞病毒Ａ和Ｂ。 这些病毒可引起广泛的急性上呼吸道和下呼吸道疾病。在 儿童．高龄以及免疫缺陷人群，呼吸道病毒可以引起严重的 ｌ临床表现需要住院治疗，如哮喘、支气管炎和肺炎。通过细 胞培养进行病毒分离以及单克隆抗体进行直接免疫荧光抗 体染色是临床实验室最常用的检测呼吸道病毒技术。Ａｌｍａ 等”引报道了结合多重ＰＣＲ和酶联扩增产物杂交实验 （ＥＬＡＨＡ）的研究结果．因为引入了生物素标记的特异性探 针，提高了实验的敏感性和特异性；同时引入了ＰＣＲ反应的 内对照，所用的内对照。来源于人内源性逆转录病毒序列。 ＰＣＲ反应的一个缺陷是由于ｌＩ缶床标本中存在ＰＣＲ反应抑制 物，而在提取过程中不能去除从而导致假阴性结果的出现。 此方法可以同时检测腺病毒、流感病毒Ａ和Ｂ、呼吸道合胞 病毒Ａ和Ｂ，以及副流感病毒１，２，和３。对５９８份疑为上 呼吸道感染患者的鼻咽吸出物进行７种病毒的检测，每个实 验的特异性为１００％，与ＤＦＡ以及结合培养扩增（ＣＡ．ＤＦＡ）方 法比较，敏感性分别为７９．７％和８８．６％。与ＤＦＡ和ＣＡ－ＤＦＡ 方法相比较，ｍ－ＲＴ－ＰＣＲ．ＥＬＡＨＡ方法的敏感性、特异性和快 速性以及费用的降低都表明，在临床实验室该方法比传统的 呼吸道病毒检测方法有明显的改进。另外，ｍ．ＲＴ－ＰＣＲ－ ＥＬＡＨＡ可以作为评价一种新的病毒疫苗效果的有用工具。
腺病毒能被中和抗体识别的型特异性的抗原决定簇位 于六邻体表面，但也出现在纤维蛋白，少数存在于五邻体蛋 白基底部分上。六邻体蛋白的抗原决定簇被绘成Ｌｌ和Ｌ２ 两个Ｌｏｏｐｓ，并被分成７个高变区，ＨＶＲＩ．６（Ｌ１）和ＨＶＲ７（１２）， 高变区可以导致异常重组。据报道，这些高变区占六邻体 ＳＮ型特异性的抗原决定簇的９９％以上，多数情况下，ＨＶＲＩ．６ 序列测定可以明显区分血清型，甚至是对那些用免疫学方法 很难区分的血清型，而且还可以发现型内重组的证据，研究 结果表明正常重组和异常重组都归功于ＨＶＲｓ的多态性，有 趣的是正常重组对六邻体基因的高度同源性要求是很严格 的【６ Ｊ。基于六邻体基因ＨＶＲｌ．７的分子分型和用于腺病毒 新的变异株的发现已经得到广泛应用，所以成为腺病毒分子 分型的热点ｎ删。Ｒｉｋａ等＂３建立了一个可以对腺病毒定量 检测并同时分型的方法：利用一套引物用Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ， 能扩增５１个原型株的六邻体基因的５５４ ｂｐ片段，同时结膜 炎和呼吸道患者腺病毒的检出率分别为７４．４％和２７．３％。 另外，基于更短的一段３５０ ｂｐ的六邻体基因序列的进化树分 型结果与中和实验和血凝抑制实验的符合性很好，２个血清 型Ａｄｌ８和Ａｄ４１除外。Ｃａｓａｓ博１报告了基于六邻体保守区５４０ ．６６０氨基酸的ＤＮＡ序列测定并结合进化树分析可以有效 地识别腺病毒大多数血清型。通过对１５７个序列（８６个预先 分过型的和７１个临床分离标本）的分析发现，种和型的正确 率分别为１００％和８４％。研究发现设计通用引物扩增六邻 体基因高变区１．６，扩增产物测序后的结果与ＧｅｎＢａｎｋ数据 和ｈｌ等【９１的结果符合率９９０％，该方法与血清学和其他分 子生物学方法在腺病毒分型方面有很好的符合性。Ｔａｋｅｕｃｈｉ 等¨州通过对腺病毒１６个原型株的交叉同源性研究，建议用 ＰＣＲ扩增和六邻体ＨＶＲｓ直接测序，可以对结膜炎患者的结 膜拭子标本中的腺病毒分型；同时以ＨＶＲ４，５，和７作为备 选区域。Ｂｌａｓｉｏｌｅ等…１也用这种方法尝试对部队腺病毒分离 株进行分析，但是，因为ＨＶＲｓ包含一个很长的六邻体基因 的不连续区域．所以还需要多重ＰＣＲ和序列测定。而且．不 是所有的腺病毒原型株的ＨＶＲ参考序列都能得到。因此也 限制了这一区域用于分型研究。最近的研究表明，六邻体基 因的较短区域与血清型相关，所以用于常规分型更有实用价 值。Ｓａｒａｎｔｉｓ等¨２１报道了一种ＰＣＲ和ＨＶＲ７序列测定方法，
在美国Ａｄ４和Ａｄ７最常与成人呼吸道感染相关，其次是 Ａｄ２１和Ａｄ３【Ｉ刮；而由腺病毒引起的呼吸道感染在临床上很 难与其他细菌和病毒引起的感染进行区分，所以建立腺病毒 感染的临床微生物诊断方法势在必行。Ｂａｏｃｈｕａｎ等”刘尝试 结合荧光定量多重ＰＣＲ和微矩阵分析对呼吸道急性感染相 关腺病毒进行快速检测和分型，本方法可以在６０ ｍｉｎ内检 测临床和实验室标本，并在９０ ｍｉｎ内判定型别。检测的敏感 性为ｌ一１００基因组拷贝，与传统方法相媲美，一次试验能解 决污染问题。此方法可用于腺病毒共感染、污染、以及有可 能重组的情况发生时，而且在１．５．４ ｈ之内可以做到腺病毒 相关的急性呼吸道感染的快速诊断和分型。建立一个快速 可靠的腺病毒检测平台需要考虑３个因素：靶基因和探针的 设计与选择以及扩增策略。根据其功能以及在腺病毒线性 基因组中的位置，选择３种靶基因：ＥＩＡ，六邻体和纤维蛋白 基因作探针，ＥＩＡ在５’端，编码一种早期转录基因所必须的 转录调节因子；六邻体和纤维蛋白基因，位于基因组的３’端， 分别编码决定腺病毒血清型的抗原决定簇￡和＾。与其他基 于单一诊断区域的分子生物学检测方法相比，选取３个基因 位点作为靶片段可以避免由于杂交错配产生的错误。这一点 对由于病毒的进化或病毒血清型的多样性导致的重组特别 有意义。微距阵技术因其靶病毒基因组的广谱性，将是腺病 毒检测最有前景的应用技术之一。
基金项目：国家高科技研究发展８６３计划（２００７ＡＡ０２２４６３） 作者单位：１０００５２北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控 制所
通信作者：唐浏英，Ｅ－ｍａｉｈｔａｎｇｌｙ８１２＠ｈｏｔｍａｉｌ．咖
２免疫学实验
由于腺病毒感染性疾病及症状的多样性，通过抗原与特 异性抗体的检测可以进行鉴别诊断。ＥＬＩＳＡ方法可以用于 定性和（或）定量检测人血清或血浆中抗腺病毒的１０：／ｌｇＡ抗 体，它包括所有对人体致病的各种血清型的腺病毒。ＥＬｌＳＡ 检测ＩｇＡ则用于腺病毒急性呼吸道感染的诊断和鉴别诊断。 血清阳性的高普及率与儿童阶段早期不同亚型腺病毒的重 复感染有关。如果发现双份血样ＩｇＧ抗体浓度增加４倍，则 表明是腺病毒急性感染。但是抗体检测技术不能区分血清 型别。
Biblioteka Baidu
所有原型株的序列的这一区域都可以做亲缘性关系分析。 但是对测定的序列没有用免疫分型的结果去验证，而且因为 分离株数量所限，不足以验证该方法的有效性。Ｓｈｉｍａｄａ 等”孔研究了一种六邻体基因ＨＶＲｓ更保守的序列，能检测 ４４个原型株的序列但对野病毒的检测只严格限定于流行性 角膜结膜炎相关的血清型。另外，该区域的变化很大程度上 依赖于菲编码核苷酸的替换，则对某些分离株的结果不好解 释，而且关系较为密切的血清型在这一区域的重组将导致分 型错误。ｈ等旧１对六邻体基因ＰＣＲ和ＨＶＲＩ．６区序列测定． 并用收集的大量已知血清型的野病毒分离株与数据库中５１ 个原型株的ＨＶＲＩ．６序列相比较，表明此方法可用于临床标 本的直接分型。
·３９ｌ ·
．综述．
腺病毒分型与诊断方法研究进展
唐浏英
人腺病毒属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属．到目前为 止，人腺病毒共分离到５２个血清型，分属于Ａ．Ｇ７个亚 属：“。
腺病毒是呼吸道和结膜炎的重要病原因子，咽结膜热也 是广为人知的腺病毒疾病。此外，腺病毒引起免疫缺陷患者 的致命性的感染也越来越为人们所熟知。腺病毒引起的呼 吸道、泌尿道以及胃肠道感染在临床表现方面与其他病原微 生物的感染非常相似，因此，仅根据临床表现来进行疾病的 诊断是比较困难的，需要进行实验室诊断加以证实。而且不 同血清型的腺病毒有不同的致病谱，特定血清型又通常与疾 病的严重程度和临床表现相关，临床医生和公共卫生官员需 要实验室结果，便于他们特异性地评价和治疗患者以及对腺 病毒引起的疾病的暴发进行快速应答。所以腺病毒感染的 快速诊断和分型，对流行病学检测和临床选择最佳治疗方案 都很关键。腺病毒感染的诊断与分型主要应用病毒分离技 术、抗体检测技术，以及分子生物学技术（如聚合酶链反应、 限制性片段长度多态性分析技术、原位杂交技术、实时荧光 定量ＰＣＲ技术）等。本文对目前常用的腺病毒检测和诊断 方法加以综述。
最近几年，ＰＣＲ因其敏感、快速和准确被应用到腺病毒 的检测和诊断中。在许多研究中，ＰＣＲ用于直接从各种临床 标本中检测腺病毒，与病毒分离相比。敏感性可达到７６％． １００％，应用ＰＣＲ技术，通常在几个小时之内完成对标本的检 测，而对扩增产物进～步测序则可以获得有用的分型信息， 如区分基因型，血清型【．】。据报道用针对六邻体蛋白、纤维 蛋白基因和ＶＡ区的种或型特异性引物的ＰＣＲ实验．可以区
３分子生物学技术
分子分型策略在评价腺病毒感染流行和个体发病时极 为有用。例如，器官移植专业的医生可以用分子分型方法来 区分患者是近期腺病毒感染，社区获得性感染还是与供体相 关的腺病毒感染。同时分子分型能够为临床医生和公共卫 生官员快速提供结果，便于他们特异性地评价和治疗患者以 及对腺病毒引起疾病的暴发作出快速应答。
１分离和血清分型
病毒分离技术通常被认为是腺病毒感染诊断的金标 准【２ Ｊ，临床标本接种敏感细胞，如Ｇｒａｈａｍ２９３，Ａ５４９，Ｈｅｐ－２等 细胞．通过细胞培养观察ＣＰＥ，分离腺病毒。通过病毒增殖， 还可以为进一步的分子生物学试验提供更多病原学信息。 腺病毒血清分型主要依据中和试验，血凝抑制试验，前者通 过直接检测腺病毒六邻体蛋白的抗原决定簇，而后者则根据 五邻体蛋白的抗原决定簇的检测结果而判定血清型。这些 方法通常需要３天到３星期的时间得到肯定结果，这依赖于 标本的来源和标本中病毒的含量，同时结果的解释还依靠有 经验的专业人员，费时费力而且有时会产生模棱两可的结 果。另外，得到结果的时间太长也不利于临床的治疗和隔 离。
上述研究表明，ＰＣＲ扩增六邻体蛋白基因和基因序列 测定有可能取代以往传统的血清分型方法，但是该方法也 有其局限性：尽管９８％的标本分型一致。但是。只根据六邻 体基因的高变异区对分离株进行分型，有可能会遗漏一些与 宿主免疫应答和毒力密切相关的毒株的其他重要的遗传学 差异。例如，五邻体蛋白含有细胞受体的结合位点，这些位 点的改变可能影响腺病毒的组织嗜性；同样，编码某些早期 蛋白的基因有可能影响腺病毒在细胞中的传播，所以该方 法还应该结合腺病毒分子分型的其他方法以降低腺病毒重 组体漏检的风险。 ３．３ ＰＣＲ结合基因芯片技术
一段时间内，放射性免疫和酶免疫实验因其高度敏感性 而取代操作繁琐的补体结合实验，但因放射性物质的环境危 害未能推广使用幢１。直接免疫荧光（ＤＦＡ）快速诊断技术也 为多数临床实验室所接受。在我国，有人研制了某些型特异 性的腺病毒的单克隆抗体，因为存在试剂的标准化等问题， 这些试剂没有广泛应用。用于腺病毒感染患者床边诊断的 免疫层析（ＩＣ）试剂盒在日本已经面市并做了评估。与常规 Ｉ＇ＣＲ、ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ和病毒分离方法比较，结果发现。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｉ＇ＣＲ方法最敏感，病毒分离次之，Ｉｃ敏感性最低。但 是实验证明，Ｉｃ是一种有用的床边诊断方法，腺病毒感染仅 凭临床表现很难诊断，实验很大程度上依赖于标本的采 集ｂ］。要非常注意标本的收集、运输和保存各环节。ｌＣ应用 的是Ａｄ２的六邻体蛋白的单克隆抗体，所以对３、７型的敏感 性低于Ａｄ４。
万方数据
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分某些血清型；最近，腺病毒的ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法也有 人尝试ｂ】。Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法产生结果快速，并能得到定量 数据。 ３．１ ＰＣＲ．Ｒ凡Ｐ
２０世纪８０年代早期，代替免疫学分型的ＰＣＲ．ＲＦＬＰ分子 分型技术的建立，因它可以评估腺病毒整个基因组内的基因 变异特征而成为腺病毒某些血清型的分型手段。该技术在 某些实验室还在应用，但是这种方法也有缺点，需要培养病 毒，另外，如果酶切位点出现突变，限制性片段长度多态性分 析也可能是失败的，而且当出现新ＲＦＬＰｓ带型时很难解释。 ３．２ ＰＣＲ．序列测定
常见的呼吸道感染病毒性病原因子包括腺病毒、流感病
万方数据
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毒Ａ和Ｂ、副流感病毒１、２和３以及呼吸道合胞病毒Ａ和Ｂ。 这些病毒可引起广泛的急性上呼吸道和下呼吸道疾病。在 儿童．高龄以及免疫缺陷人群，呼吸道病毒可以引起严重的 ｌ临床表现需要住院治疗，如哮喘、支气管炎和肺炎。通过细 胞培养进行病毒分离以及单克隆抗体进行直接免疫荧光抗 体染色是临床实验室最常用的检测呼吸道病毒技术。Ａｌｍａ 等”引报道了结合多重ＰＣＲ和酶联扩增产物杂交实验 （ＥＬＡＨＡ）的研究结果．因为引入了生物素标记的特异性探 针，提高了实验的敏感性和特异性；同时引入了ＰＣＲ反应的 内对照，所用的内对照。来源于人内源性逆转录病毒序列。 ＰＣＲ反应的一个缺陷是由于ｌＩ缶床标本中存在ＰＣＲ反应抑制 物，而在提取过程中不能去除从而导致假阴性结果的出现。 此方法可以同时检测腺病毒、流感病毒Ａ和Ｂ、呼吸道合胞 病毒Ａ和Ｂ，以及副流感病毒１，２，和３。对５９８份疑为上 呼吸道感染患者的鼻咽吸出物进行７种病毒的检测，每个实 验的特异性为１００％，与ＤＦＡ以及结合培养扩增（ＣＡ．ＤＦＡ）方 法比较，敏感性分别为７９．７％和８８．６％。与ＤＦＡ和ＣＡ－ＤＦＡ 方法相比较，ｍ－ＲＴ－ＰＣＲ．ＥＬＡＨＡ方法的敏感性、特异性和快 速性以及费用的降低都表明，在临床实验室该方法比传统的 呼吸道病毒检测方法有明显的改进。另外，ｍ．ＲＴ－ＰＣＲ－ ＥＬＡＨＡ可以作为评价一种新的病毒疫苗效果的有用工具。
腺病毒能被中和抗体识别的型特异性的抗原决定簇位 于六邻体表面，但也出现在纤维蛋白，少数存在于五邻体蛋 白基底部分上。六邻体蛋白的抗原决定簇被绘成Ｌｌ和Ｌ２ 两个Ｌｏｏｐｓ，并被分成７个高变区，ＨＶＲＩ．６（Ｌ１）和ＨＶＲ７（１２）， 高变区可以导致异常重组。据报道，这些高变区占六邻体 ＳＮ型特异性的抗原决定簇的９９％以上，多数情况下，ＨＶＲＩ．６ 序列测定可以明显区分血清型，甚至是对那些用免疫学方法 很难区分的血清型，而且还可以发现型内重组的证据，研究 结果表明正常重组和异常重组都归功于ＨＶＲｓ的多态性，有 趣的是正常重组对六邻体基因的高度同源性要求是很严格 的【６ Ｊ。基于六邻体基因ＨＶＲｌ．７的分子分型和用于腺病毒 新的变异株的发现已经得到广泛应用，所以成为腺病毒分子 分型的热点ｎ删。Ｒｉｋａ等＂３建立了一个可以对腺病毒定量 检测并同时分型的方法：利用一套引物用Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ， 能扩增５１个原型株的六邻体基因的５５４ ｂｐ片段，同时结膜 炎和呼吸道患者腺病毒的检出率分别为７４．４％和２７．３％。 另外，基于更短的一段３５０ ｂｐ的六邻体基因序列的进化树分 型结果与中和实验和血凝抑制实验的符合性很好，２个血清 型Ａｄｌ８和Ａｄ４１除外。Ｃａｓａｓ博１报告了基于六邻体保守区５４０ ．６６０氨基酸的ＤＮＡ序列测定并结合进化树分析可以有效 地识别腺病毒大多数血清型。通过对１５７个序列（８６个预先 分过型的和７１个临床分离标本）的分析发现，种和型的正确 率分别为１００％和８４％。研究发现设计通用引物扩增六邻 体基因高变区１．６，扩增产物测序后的结果与ＧｅｎＢａｎｋ数据 和ｈｌ等【９１的结果符合率９９０％，该方法与血清学和其他分 子生物学方法在腺病毒分型方面有很好的符合性。Ｔａｋｅｕｃｈｉ 等¨州通过对腺病毒１６个原型株的交叉同源性研究，建议用 ＰＣＲ扩增和六邻体ＨＶＲｓ直接测序，可以对结膜炎患者的结 膜拭子标本中的腺病毒分型；同时以ＨＶＲ４，５，和７作为备 选区域。Ｂｌａｓｉｏｌｅ等…１也用这种方法尝试对部队腺病毒分离 株进行分析，但是，因为ＨＶＲｓ包含一个很长的六邻体基因 的不连续区域．所以还需要多重ＰＣＲ和序列测定。而且．不 是所有的腺病毒原型株的ＨＶＲ参考序列都能得到。因此也 限制了这一区域用于分型研究。最近的研究表明，六邻体基 因的较短区域与血清型相关，所以用于常规分型更有实用价 值。Ｓａｒａｎｔｉｓ等¨２１报道了一种ＰＣＲ和ＨＶＲ７序列测定方法，
在美国Ａｄ４和Ａｄ７最常与成人呼吸道感染相关，其次是 Ａｄ２１和Ａｄ３【Ｉ刮；而由腺病毒引起的呼吸道感染在临床上很 难与其他细菌和病毒引起的感染进行区分，所以建立腺病毒 感染的临床微生物诊断方法势在必行。Ｂａｏｃｈｕａｎ等”刘尝试 结合荧光定量多重ＰＣＲ和微矩阵分析对呼吸道急性感染相 关腺病毒进行快速检测和分型，本方法可以在６０ ｍｉｎ内检 测临床和实验室标本，并在９０ ｍｉｎ内判定型别。检测的敏感 性为ｌ一１００基因组拷贝，与传统方法相媲美，一次试验能解 决污染问题。此方法可用于腺病毒共感染、污染、以及有可 能重组的情况发生时，而且在１．５．４ ｈ之内可以做到腺病毒 相关的急性呼吸道感染的快速诊断和分型。建立一个快速 可靠的腺病毒检测平台需要考虑３个因素：靶基因和探针的 设计与选择以及扩增策略。根据其功能以及在腺病毒线性 基因组中的位置，选择３种靶基因：ＥＩＡ，六邻体和纤维蛋白 基因作探针，ＥＩＡ在５’端，编码一种早期转录基因所必须的 转录调节因子；六邻体和纤维蛋白基因，位于基因组的３’端， 分别编码决定腺病毒血清型的抗原决定簇￡和＾。与其他基 于单一诊断区域的分子生物学检测方法相比，选取３个基因 位点作为靶片段可以避免由于杂交错配产生的错误。这一点 对由于病毒的进化或病毒血清型的多样性导致的重组特别 有意义。微距阵技术因其靶病毒基因组的广谱性，将是腺病 毒检测最有前景的应用技术之一。
基金项目：国家高科技研究发展８６３计划（２００７ＡＡ０２２４６３） 作者单位：１０００５２北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控 制所
通信作者：唐浏英，Ｅ－ｍａｉｈｔａｎｇｌｙ８１２＠ｈｏｔｍａｉｌ．咖
２免疫学实验
由于腺病毒感染性疾病及症状的多样性，通过抗原与特 异性抗体的检测可以进行鉴别诊断。ＥＬＩＳＡ方法可以用于 定性和（或）定量检测人血清或血浆中抗腺病毒的１０：／ｌｇＡ抗 体，它包括所有对人体致病的各种血清型的腺病毒。ＥＬｌＳＡ 检测ＩｇＡ则用于腺病毒急性呼吸道感染的诊断和鉴别诊断。 血清阳性的高普及率与儿童阶段早期不同亚型腺病毒的重 复感染有关。如果发现双份血样ＩｇＧ抗体浓度增加４倍，则 表明是腺病毒急性感染。但是抗体检测技术不能区分血清 型别。
Biblioteka Baidu
所有原型株的序列的这一区域都可以做亲缘性关系分析。 但是对测定的序列没有用免疫分型的结果去验证，而且因为 分离株数量所限，不足以验证该方法的有效性。Ｓｈｉｍａｄａ 等”孔研究了一种六邻体基因ＨＶＲｓ更保守的序列，能检测 ４４个原型株的序列但对野病毒的检测只严格限定于流行性 角膜结膜炎相关的血清型。另外，该区域的变化很大程度上 依赖于菲编码核苷酸的替换，则对某些分离株的结果不好解 释，而且关系较为密切的血清型在这一区域的重组将导致分 型错误。ｈ等旧１对六邻体基因ＰＣＲ和ＨＶＲＩ．６区序列测定． 并用收集的大量已知血清型的野病毒分离株与数据库中５１ 个原型株的ＨＶＲＩ．６序列相比较，表明此方法可用于临床标 本的直接分型。
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．综述．
腺病毒分型与诊断方法研究进展
唐浏英
人腺病毒属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属．到目前为 止，人腺病毒共分离到５２个血清型，分属于Ａ．Ｇ７个亚 属：“。
腺病毒是呼吸道和结膜炎的重要病原因子，咽结膜热也 是广为人知的腺病毒疾病。此外，腺病毒引起免疫缺陷患者 的致命性的感染也越来越为人们所熟知。腺病毒引起的呼 吸道、泌尿道以及胃肠道感染在临床表现方面与其他病原微 生物的感染非常相似，因此，仅根据临床表现来进行疾病的 诊断是比较困难的，需要进行实验室诊断加以证实。而且不 同血清型的腺病毒有不同的致病谱，特定血清型又通常与疾 病的严重程度和临床表现相关，临床医生和公共卫生官员需 要实验室结果，便于他们特异性地评价和治疗患者以及对腺 病毒引起的疾病的暴发进行快速应答。所以腺病毒感染的 快速诊断和分型，对流行病学检测和临床选择最佳治疗方案 都很关键。腺病毒感染的诊断与分型主要应用病毒分离技 术、抗体检测技术，以及分子生物学技术（如聚合酶链反应、 限制性片段长度多态性分析技术、原位杂交技术、实时荧光 定量ＰＣＲ技术）等。本文对目前常用的腺病毒检测和诊断 方法加以综述。
最近几年，ＰＣＲ因其敏感、快速和准确被应用到腺病毒 的检测和诊断中。在许多研究中，ＰＣＲ用于直接从各种临床 标本中检测腺病毒，与病毒分离相比。敏感性可达到７６％． １００％，应用ＰＣＲ技术，通常在几个小时之内完成对标本的检 测，而对扩增产物进～步测序则可以获得有用的分型信息， 如区分基因型，血清型【．】。据报道用针对六邻体蛋白、纤维 蛋白基因和ＶＡ区的种或型特异性引物的ＰＣＲ实验．可以区
３分子生物学技术
分子分型策略在评价腺病毒感染流行和个体发病时极 为有用。例如，器官移植专业的医生可以用分子分型方法来 区分患者是近期腺病毒感染，社区获得性感染还是与供体相 关的腺病毒感染。同时分子分型能够为临床医生和公共卫 生官员快速提供结果，便于他们特异性地评价和治疗患者以 及对腺病毒引起疾病的暴发作出快速应答。
１分离和血清分型
病毒分离技术通常被认为是腺病毒感染诊断的金标 准【２ Ｊ，临床标本接种敏感细胞，如Ｇｒａｈａｍ２９３，Ａ５４９，Ｈｅｐ－２等 细胞．通过细胞培养观察ＣＰＥ，分离腺病毒。通过病毒增殖， 还可以为进一步的分子生物学试验提供更多病原学信息。 腺病毒血清分型主要依据中和试验，血凝抑制试验，前者通 过直接检测腺病毒六邻体蛋白的抗原决定簇，而后者则根据 五邻体蛋白的抗原决定簇的检测结果而判定血清型。这些 方法通常需要３天到３星期的时间得到肯定结果，这依赖于 标本的来源和标本中病毒的含量，同时结果的解释还依靠有 经验的专业人员，费时费力而且有时会产生模棱两可的结 果。另外，得到结果的时间太长也不利于临床的治疗和隔 离。
上述研究表明，ＰＣＲ扩增六邻体蛋白基因和基因序列 测定有可能取代以往传统的血清分型方法，但是该方法也 有其局限性：尽管９８％的标本分型一致。但是。只根据六邻 体基因的高变异区对分离株进行分型，有可能会遗漏一些与 宿主免疫应答和毒力密切相关的毒株的其他重要的遗传学 差异。例如，五邻体蛋白含有细胞受体的结合位点，这些位 点的改变可能影响腺病毒的组织嗜性；同样，编码某些早期 蛋白的基因有可能影响腺病毒在细胞中的传播，所以该方 法还应该结合腺病毒分子分型的其他方法以降低腺病毒重 组体漏检的风险。 ３．３ ＰＣＲ结合基因芯片技术
一段时间内，放射性免疫和酶免疫实验因其高度敏感性 而取代操作繁琐的补体结合实验，但因放射性物质的环境危 害未能推广使用幢１。直接免疫荧光（ＤＦＡ）快速诊断技术也 为多数临床实验室所接受。在我国，有人研制了某些型特异 性的腺病毒的单克隆抗体，因为存在试剂的标准化等问题， 这些试剂没有广泛应用。用于腺病毒感染患者床边诊断的 免疫层析（ＩＣ）试剂盒在日本已经面市并做了评估。与常规 Ｉ＇ＣＲ、ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ和病毒分离方法比较，结果发现。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｉ＇ＣＲ方法最敏感，病毒分离次之，Ｉｃ敏感性最低。但 是实验证明，Ｉｃ是一种有用的床边诊断方法，腺病毒感染仅 凭临床表现很难诊断，实验很大程度上依赖于标本的采 集ｂ］。要非常注意标本的收集、运输和保存各环节。ｌＣ应用 的是Ａｄ２的六邻体蛋白的单克隆抗体，所以对３、７型的敏感 性低于Ａｄ４。
万方数据
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分某些血清型；最近，腺病毒的ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法也有 人尝试ｂ】。Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法产生结果快速，并能得到定量 数据。 ３．１ ＰＣＲ．Ｒ凡Ｐ
２０世纪８０年代早期，代替免疫学分型的ＰＣＲ．ＲＦＬＰ分子 分型技术的建立，因它可以评估腺病毒整个基因组内的基因 变异特征而成为腺病毒某些血清型的分型手段。该技术在 某些实验室还在应用，但是这种方法也有缺点，需要培养病 毒，另外，如果酶切位点出现突变，限制性片段长度多态性分 析也可能是失败的，而且当出现新ＲＦＬＰｓ带型时很难解释。 ３．２ ＰＣＲ．序列测定