血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)

改变了丙酮酸含量的测定方 法 丙酮酸+2，4-二硝基苯肼 丙酮酸2，4 -二硝基苯腙 +H2O


改良赖氏法
赖氏法的测定方法+卡门氏法 的酶单位定义
实验目的

1.了解血清丙氨酸氨基转移酶活性单位的定义 2.掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的方法 （改良赖氏法）和临床意义
实验原理

在实验条件下，以丙氨酸和 α- 酮戊二酸作为第底物，经转氨酶的作用， 生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的生成量，即可计算酶活性的大 小
实验原理
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝 基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基 苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝 醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮 酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关 系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较， 便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活 性。

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临床意义

ALT（GPT)广泛存在于机体各种组织中，但 在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是 急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显 著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此 酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组 织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项


1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清 对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本 进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检 查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的 标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的 问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦 能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大 差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
什么是改良赖氏法？
卡门法

赖氏法


丙酮酸+α-酮戊二酸 谷氨酸+丙氨酸 丙酮酸→NAD++乳酸 在紫外分光光度法中，NADH在 340nm波长处的吸光度降低值与ALT 活性成正比。 卡门氏酶单位：1ml血清（反应溶液 总量为3ml）在340nm波长下，用内 径喂1.0cm的比色皿，在25摄氏度， 1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢 酶催化下，使NADH+H+变成NAD+， 光密度下降0.001为一个转氨酶活性 单位。
实验试剂



1.ALT底物液：称取分析纯α-酮戊二酸39.2mg，丙氨酸1.78g，置于干 净小烧杯内，先用50ml碳酸缓冲液（pH=7.4）溶解，然后用 1mol/LNaOH校正pH至7.4（约需0.5ml），再以pH7.4的磷酸缓冲液稀 释至100ml，加氯仿数滴，防止变质。 2.pH=7.4磷酸缓冲液（PBS）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4)13.97g及 磷酸二氢钠（KH2PO4)2.69g溶解于1000ml蒸馏水中 3.丙酮酸标准液（2mmol/L）：准确称取干燥至恒重的丙酮酸钠22mg， 以磷酸缓冲液洗入100ml容量瓶中，混合，再以磷酸缓冲液稀释至刻度。 本液应新鲜配制。 4. 2，4-二硝基苯肼溶液（1mol/L）：称取2，4-二硝基苯肼19.8mg先溶 于10ml 1.0mol/LHCL中，溶解后，加水至100ml。 5.0.4mol/LNaOH
2.酶活性的测定：取试管2支，注明测定管及对照管，
在测定前将底物液在37摄氏度水浴中预温5分钟，再按下表操作

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混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用 520nm波长比色，读取光密度，用测定管的光 密度减去对照管的光密度查标准曲线，即得到 待测血清中所含ALT的酶的活性。 参考值：5~25卡门氏单位
实验操作

取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S 管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测 定管，在30min保温期间再做空白管和标准管
1.标准曲线绘制：取试管5支，按下表操作

混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用 520nm波长比色，读取各管光密度。各管光密 度减去0管光密度，然后以光密度的差值为纵 坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标， 绘制标准曲线。为了方便，可将光密度相当于 转氨酶的卡门氏单位列于其后
实验原理
实验原理
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物 而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如
丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所
用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法 一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议 国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规 生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全 国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测 定（改良赖氏法）
第六小组
关于丙氨酸氨基转移酶ALT
转氨基作用

指的是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮 酸上的过程。转氨基作用是氨基酸脱氨基作用 的一种途径。其实可以看成是氨基酸的氨基与 α-酮酸的酮基进行了交换。
谷丙转氨酶

谷丙转氨酶是临床上进行肝功能测试的一个标 准，来确定肝脏是否健康。它也被叫做血清谷 氨酸丙酮酸转氨酶（serum glutamate pyruvate transaminase，简称SGPT）或丙 氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，简 称ALAT）。诊断上，基本上都是以“单位每 升”（U/L）为单位进行测量。