FISH技术在血液疾病诊断中的应用

A
B
C
EGR1
A: nuc ish(D5S23/D5S721×1,EGR1×1) B: nuc ish(D5S23/D5S721×2,EGR1×1) C: nuc ish(D5S23/D5S721×3,EGR1×1)
质量控制
质量管理内容
商品探针、自配试剂验证 标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作） 规范判读标准 建立本实验室判读阈值 建立临床生物参考区间
检测目的
t(15;17) t(8;21) t(v;11) inv(16)；t(16;16) t(3;3);inv(3)
探针种类 急性淋系白血病（ALL）： BCR/ABL (融合探针) t(9;22)
检测目的
TEL/AML1 (融合探针) TCF3/PBX1 (融合探针)
MLL（11q23）(分离探针) IGH（14q32）(分离探针)
BCL6（3q27）(分离探针)
BCL2（18q21）(分离探针)IGH/BCL2
涉及BCL6基因异常初筛
涉及BCL2基因异常初筛
探针种类
检测目的
多发性骨髓瘤（MM）：（建议应用CD138分选细胞） RB-1（13q14）(位点探针) IGH（14q32）(分离探针) RB-1基因缺失 涉及IGH基因异常初筛 初筛检测
FISH探针种类
着丝粒探针
位点探针
涂染探针
双色单融合探针
额外信号探针
双色双融合探针
正 常
异 常
双色分离探针
数量、位点探针
人类细胞遗传学命名
nuc ish(CEP8×2)[400]
nuc ish(BCR,ABL)×2[400]
nuc ish(BCR,ABL)×3,(BCR con ABL×2)[380/400]
1950-1960
1960-1970
1970-1980
1980-1990
1956 确定 染色 体46 条
1958 应用 于血 液学
多种血 液病相 关异常 核型被 发现
多色 FISH
微阵列技术 aCGH、aSNP
非显带时期
显带时期
分子遗传
FISH技术的发展
1990年 FISH
1992年
CGH
1996年
nuc ish(MLL×2)[400]
nuc ish(MLL×2)(5’MLL sep 3’MLL×1)[100/200]
nuc ish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398]
ABL BCR
ABL BCR
A
B
A: nuc ish(ABL,BCR)×2 B: nuc ish(ABL ×2,BCR ×3)
FISH技术的特点
• 操作简便，稳定，人员培训较快 • 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，24小时就可以完成检测 • 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测 • 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞
24色FISH
（SKY、M-FISH、RX-FISH）
2001年
array CGH
技术原理
Specimen DNA
G C T G A
T
A
T
F
A
A
G
COVALENT BOND
T
C
C
F
FISH Probe DNA
操作步骤
FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备） 探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针） 探针标记 杂交（76℃变性10min、37℃杂交10h） 洗脱 DAPIⅡ复染 荧光显微镜检测 结果分析
FISH技术的局限性
异常检测取决于能否获得相应探针 三体检测敏感性高于单体或缺失 骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理 不能检测全基因组异常（间期FISH）
FISH主要仪器
FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件） 荧光原位杂交仪 恒温水浴槽 高速离心机 培养箱 微量加样器 pH仪
荧光原位杂交（FISH）技术
——血液肿瘤诊疗中的应用
一、技术 二 、质控 三、 临床应用 技术理论 四、多技术结合应用案例
细胞遗传学发展简史
1888 提出 染色 体 1914 染色体 畸变导 致肿瘤 1960 发现Ph 染色体 CML 显带技 术高速 发展 G/R FISH 中期/间期
CGH技术
FISH常用探针的组合应用
探针种类 慢性粒细胞白血病（CML）： BCR/ABL (融合探针) BCR/ABL/ASS1 t(9;22) t(9;22)伴ASS1基因缺失 检测目的
ຫໍສະໝຸດ Baidu
探针种类 急性髓系白血病（AML）： PML/RARa (融合探针) RARa AML1/ETO (融合探针) MLL（11q23）(分离探针) CBFB（16q22）(分离探针) EVI1(3q26) (分离探针)
t(12;21) t(1;19)
t(v;11) t(v;14)
探针种类 骨髓增生异常综合征（MDS）：
CEP8 (位点探针) +8
检测目的
EGR1/D5S721（5q31;5p15.2） (双位点探针)
D7S486/CEP7（7q31;7p11-7q11） (双位点探针) D20S108（20q12）(位点探针)
探针种类
检测目的
伴嗜酸细胞增多的髓系或淋系肿瘤、MDS、MPN FGFR1/D8Z2(8p11) (分离探针) PDGFRA（4q12） PDGFRB（5q32-q33） 移植排斥检测： CEPX/Y (双位点探针) XX和XY t(8;13) 4q12 t(5;12)
结语
精准方法，细致分析 新技术及多学科技术联合 探讨特征性染色体异常分子机制 疗效判断预后评估，指导靶向和个体化治疗
FISH技术比较
FISH SKY M-FISH RX-FISH CGH aCGH
全染色体扫描
平衡易位
×
√
√
√
√
部分
√
×
√
×
不平衡易位
倒位 缺失 扩增 非整倍体 分辨率
√
√
√
×
部分
部分
√
×
√
×
√
√ √
1-10 kb
×
部分 √
部分
√ √
√
√ ×
3 Mb
√
√ ×
10-100kb
2-10 Mb 2-10 Mb
FISH技术要点
样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂
规范判读
• 规范正常和异常信号 • 杂交成功率>75% • 计数数量、方法： •单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞 •双人，每人于不同区域各计数200个细胞
P53（17p13.1）(位点探针)
P53基因缺失
CKS1B/CDKN2C（1q21;1p32.3） 1q21扩增;del(1p32) (双位点探针) FGFR3/IGH (融合探针) t(4;14) IGH阳性标 本后续检测 MAF/IGH (融合探针) t(14;16) CCND1/IGH (融合探针) MAFB/IGH (融合探针) t(11;14) t(14;20)
-5；del(5q31)
-7；del(7q31) del(20q12)
EVI1(3q26) (分离探针)
t(3;3);inv(3)
探针种类
淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病：
检测目的
RB-1（或D13S319)（13q14）(位点探针) del(13)(q14)
IGH（14q32）(分离探针) P53（17p13.1）(位点探针) CCND1/IGH (融合探针)CCND1 MYC（8q24）(分离探针)IGH/C-MYC ATM（11q22.3）(位点探针) CEP12 (位点探针) 涉及IGH基因异常初筛 P53基因缺失 t(11;14) 涉及MYC基因异常初筛 ATM基因缺失 +12
计数规范
信号判读误差
分离信号误判
石蜡切片误差
建立阈值
选取正常样本10-20份建立针对探针的假阳性率 统计方法 •x+3SD •β 分布（95%可信区间） 结合临床逐步建立生物参考区间
结果及报告
临床应用
FISH临床应用
检测染色体数目与结构异常 疗效分析 鉴定标记染色体 检测早期复发 鉴定移植后早期复发 鉴定肿瘤细胞的细胞系列 基因定位、病灶组织定位
ABL
BCR
ABL
BCR ABL BCR
A
B
C
A: nuc ish(ABL,BCR)×3(ABL con BCR×2) B: nuc ish(ABL,BCR)×4 (ABL con BCR×3) C: nuc ish(ABL ×3,BCR ×2) (ABL con BCR×1)
AML1
AML1
AML1
A
TEL
B
TEL/AML1
TEL
C
A: nuc ish(TEL×2,AML1×3)(TEL con AML1×1) B: nuc ish(TEL×1,AML1×4)(TEL con AML1×1) C: nuc ish(TEL×2,AML1×5)
D5S721 D5S721 EGR1 D5S721
EGR1
FISH操作流程
• 样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等 • 制片： • 预处理： • 酶消化： • 变性： 细胞悬液滴片或石蜡组织切片 2×SSC，固定液，NaSCN 胃蛋白酶，蛋白酶K 温度
• 杂交：
• 洗涤： • 复染： • 读片：
互补结合，温度
无附离子溶液，PH，温度 DAPI II 荧光显微镜，滤镜