透射电镜生物样品前处理步骤

透射电镜样品制备步骤

取材醛类前固定缓冲液漂洗饿酸固定（后固定）缓冲液漂洗脱水剂梯度脱水丙酮/环氧丙烷臵换浸透（先于不同比例包埋剂-脱水剂再纯包埋剂长时间浸透）加热聚合修快超薄切片铀铅染色1、取材：4℃冰块上迅速取材，1mm3大小，立即放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)

注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可

部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）

脑、胰等柔软组织先切成较大厚片于戊二醛固定数分钟增加硬度，再切成小块臵于新的戊二醛固定液

小肠、周围神经、肌肉等方向性、易扭曲样本可绑在小波棒上固定，待硬化后纵行方向切成长方形固定

2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min

3、锇酸固定：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作）

注：饿酸固定时间过长会导致脂蛋白复合体溶解，使组织变脆，不利于切片

3、再漂洗：吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min

注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察

骨组织漂洗后需脱钙，EDTA-2Na脱钙液

4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min

再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）

最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷臵换；Cell的固定脱水无需臵换）

注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，臵换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。

植物组织脱水时间延长，100%脱水剂中加入烤干的无水CuSO4、无水Na2SO4

5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)

②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)

③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)

注：样品周围不能有气泡

6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300 ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。

注意小肠等定向包埋

7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）

8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调

醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗

柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放臵数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察

spurr包埋剂配制：ERL 2.5g

NSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存

DER 2.5 g

DMAE 0.1g

宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。Spurr树脂是嗜氧，聚合时不加盖

包埋剂储存过久导致粘度上升，渗透性能下降，包埋块硬度不均匀，切片困难