荧光假单胞菌工程菌株的构建
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荧光假单胞菌工程菌株的构建
荧光假荧
荧光假单胞菌简介光假单胞
菌简介单胞菌简介
• 细胞有多根极生鞭毛， 可水解明胶，不产生 绿脓菌素，氧化酶反 应阳性，精氨酸双水 解酶阳性，产生黄绿 色荧光色素，不需要 生长因子，能利用葡 萄糖和芳香族化合物 生长，不利用淀粉， 细胞可为EDTA溶解， 最高生长温度为3537C。
荧光假单胞菌简介
荧光假单胞菌有8个种，其 中菊苣假单胞菌、丁香假 单胞菌和绿黄假单胞菌是 植物致病菌，铜绿假单胞 是机遇性人体致病菌，偶 尔也造成洋葱腐烂;另外4 个种是腐生性的，分别为 荧光假单胞菌，绿针假单 胞菌，致金假单胞菌和恶 臭假单胞菌．这些种类均 能产生扩散性荧光色素， 但与植物病害防治有关的 主要是荧光假单胞菌和恶 臭假单胞菌。
预期前景
• •
荧光假单胞菌对多种植物病害具有防治作用，它首先 在植物根际定殖，然后靠噬铁索对铁离子的竞争和抗生素 的拮抗作用抑制病原菌的生长发育，保护植物体免受病菌 危害，荧光菌在根际的定殖能力与它同根系分泌物的凝集 能力有关，与它在根表的短期不可逆吸附也有一定关系.
大多数好气性和兼性厌气微生物能产生一种低分子量 化合物，用以在低铁生境中获取铁索营养，这种物质对铁 离子Fe3+具有专一的高度亲和性，称为噬铁素 (Siderophore)．荧光假单胞菌的水溶性荧光色素就是一 种噬铁素，这类细菌对植物生长发育导有良好刺激作用， 并能防治某些植物根部病害，是植物病害生物防治中研究 较多的一类噬铁素产生菌。
• •
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 目的基因的获取
• 荧光假单胞菌2,4DAPG的合成基因簇已经被克隆和测序， 其中 phlACBD 作为一个操纵子负责合成 2,4DAPG 及其前 体，在其下游phlE 基因与phlACBD 共转录，与 2,4DAPG 外泌和细胞抗逆性相关，phlF基因位于phlACBD操纵子上 游，以相反的方向转录，编码一种2,4DAPG阻遏蛋白。该 蛋白在phlA和phlF间隔区与phOA位点结合阻遏了 RNA合 成酶与phlA启动子的-10区结合，抑制了phlACBD 基因的 转录，从而抑制了 2,4DAPG 的合成，但是少量合成的 2,4DAPG 与 phlF 蛋白结合，解除了这种抑制重要，可使 2,4DAPG大量合成。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 荧光假单胞菌感受态细胞的制备
• 材料及方法 1.培养基 LB培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g, 蒸馏水1000mL,pH7.5。 选择培养基:在LB培养基中加入四环素至终浓度25g/mL。 沙-玉米粉培养基:沙98份,玉米粉2份,水少许 。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 将荧光假单胞菌接种于LB液体培养基中 ,于28℃振荡培养 过夜 , 以 1% 的接种量转接于 10mL 新鲜的 LB 培养液中 , 于 28℃,240r/min振荡培养至OD约0.53,冰浴30min,离心收集 菌体,加入5mL预冷的0.025mol/L CaCl2处理2h,离心,菌体 用1mL预冷的0.025mol/L的CaCl2悬浮备用。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 转化
• 将1～2μL(约1μg)pMON5122质粒DNA与200μL感受态细 胞混匀,冰浴放置30min,42℃热激3min,冰浴中放置5min, 加入800μL LB液体培养基,振荡培养1h,按每皿100μL涂布 于含四环素的平板上,28℃培养约40h,挑取抗性菌落进行 纯培养。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 鉴定
• 工程菌株的构建策略，将pMON5122质粒通过转化方法克 隆入荧光假单胞菌感受态细胞中,根据克隆子的四环素抗 性筛选出在四环素平板上生长的转化子。提取阳性重组子 中的质粒pMON5122,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切后,产 生2个片断,大小分别为1015kb(与载体pRK415大小相同) 和6.5kb,其中的小片段为DAPG合成基因表明DAPG合成 基因已经导入荧光假单胞菌野生菌株中。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 分析：
• 大多数细菌转化方法都依据 Mandel和Higa在 1970年的发 现,首先用冰预冷的CaCl2溶液处理细菌然后作短暂的热处 理 ,该处理方法改变了细胞膜的结构 , 在受体细胞中诱导了 一种短暂的“感受态” , 使质粒 DNA 能够穿过细菌细胞膜 进入细胞 , 因此 ,CaCl2 的浓度和热处理时间对质粒的转化 至关重要。用质粒转化大肠杆菌时 , 通常 CaCl2 浓度为 011mol/L,42 ℃ 热激 90s 。但在本试验中 , 当 CaCl2 浓度为 0.025mol/L,42℃热激3min时,转化频率最高。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• CaCl2浓度对转化频率的影响 • Ca2+在低温时可以使细胞壁的通透性及细胞表面的正 电荷增加,这些改变有利于DNA的吸附和吸收。本试验用 不同浓度的CaCl2即0.020,0.025,0.030和0.040mol/L处理 荧光假单胞菌细胞,结果表明,用0.025mol/L CaCl2处理荧 光假单胞菌细胞转化频率最高,0.040mol/L CaCl2处理转 化频率最低,随着CaCl2浓度的提高,转化频率呈现升高— 降低的变化趋势,浓度超过0.025mol/L时,转化频率急速下 降。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 热激时间对转化频率的影响 • 本试验在42℃时分别处理1,2,3,4min,目的在于促进荧光 假单胞菌对DNA的吸收,热激时间直接影响转化子的形成, 结果表明,处理1,2min时,没有转化子形成,处理3,4min时,转 化频率较高
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 生长时期对转化频率的影响 • 细菌的生长时期直接影响感受态细胞的建立。取不同生长 时期的荧光假单胞菌,用0.025mol/LCaCl2处理进行转化, 结果表明,在OD约0.53时,转化频率最高,OD大于或小于 0.53时,转化频率均表现为下降趋势。
荧光假荧
荧光假单胞菌简介光假单胞
菌简介单胞菌简介
• 细胞有多根极生鞭毛， 可水解明胶，不产生 绿脓菌素，氧化酶反 应阳性，精氨酸双水 解酶阳性，产生黄绿 色荧光色素，不需要 生长因子，能利用葡 萄糖和芳香族化合物 生长，不利用淀粉， 细胞可为EDTA溶解， 最高生长温度为3537C。
荧光假单胞菌简介
荧光假单胞菌有8个种，其 中菊苣假单胞菌、丁香假 单胞菌和绿黄假单胞菌是 植物致病菌，铜绿假单胞 是机遇性人体致病菌，偶 尔也造成洋葱腐烂;另外4 个种是腐生性的，分别为 荧光假单胞菌，绿针假单 胞菌，致金假单胞菌和恶 臭假单胞菌．这些种类均 能产生扩散性荧光色素， 但与植物病害防治有关的 主要是荧光假单胞菌和恶 臭假单胞菌。
预期前景
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荧光假单胞菌对多种植物病害具有防治作用，它首先 在植物根际定殖，然后靠噬铁索对铁离子的竞争和抗生素 的拮抗作用抑制病原菌的生长发育，保护植物体免受病菌 危害，荧光菌在根际的定殖能力与它同根系分泌物的凝集 能力有关，与它在根表的短期不可逆吸附也有一定关系.
大多数好气性和兼性厌气微生物能产生一种低分子量 化合物，用以在低铁生境中获取铁索营养，这种物质对铁 离子Fe3+具有专一的高度亲和性，称为噬铁素 (Siderophore)．荧光假单胞菌的水溶性荧光色素就是一 种噬铁素，这类细菌对植物生长发育导有良好刺激作用， 并能防治某些植物根部病害，是植物病害生物防治中研究 较多的一类噬铁素产生菌。
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荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 目的基因的获取
• 荧光假单胞菌2,4DAPG的合成基因簇已经被克隆和测序， 其中 phlACBD 作为一个操纵子负责合成 2,4DAPG 及其前 体，在其下游phlE 基因与phlACBD 共转录，与 2,4DAPG 外泌和细胞抗逆性相关，phlF基因位于phlACBD操纵子上 游，以相反的方向转录，编码一种2,4DAPG阻遏蛋白。该 蛋白在phlA和phlF间隔区与phOA位点结合阻遏了 RNA合 成酶与phlA启动子的-10区结合，抑制了phlACBD 基因的 转录，从而抑制了 2,4DAPG 的合成，但是少量合成的 2,4DAPG 与 phlF 蛋白结合，解除了这种抑制重要，可使 2,4DAPG大量合成。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 荧光假单胞菌感受态细胞的制备
• 材料及方法 1.培养基 LB培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g, 蒸馏水1000mL,pH7.5。 选择培养基:在LB培养基中加入四环素至终浓度25g/mL。 沙-玉米粉培养基:沙98份,玉米粉2份,水少许 。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 将荧光假单胞菌接种于LB液体培养基中 ,于28℃振荡培养 过夜 , 以 1% 的接种量转接于 10mL 新鲜的 LB 培养液中 , 于 28℃,240r/min振荡培养至OD约0.53,冰浴30min,离心收集 菌体,加入5mL预冷的0.025mol/L CaCl2处理2h,离心,菌体 用1mL预冷的0.025mol/L的CaCl2悬浮备用。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 转化
• 将1～2μL(约1μg)pMON5122质粒DNA与200μL感受态细 胞混匀,冰浴放置30min,42℃热激3min,冰浴中放置5min, 加入800μL LB液体培养基,振荡培养1h,按每皿100μL涂布 于含四环素的平板上,28℃培养约40h,挑取抗性菌落进行 纯培养。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 鉴定
• 工程菌株的构建策略，将pMON5122质粒通过转化方法克 隆入荧光假单胞菌感受态细胞中,根据克隆子的四环素抗 性筛选出在四环素平板上生长的转化子。提取阳性重组子 中的质粒pMON5122,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切后,产 生2个片断,大小分别为1015kb(与载体pRK415大小相同) 和6.5kb,其中的小片段为DAPG合成基因表明DAPG合成 基因已经导入荧光假单胞菌野生菌株中。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 分析：
• 大多数细菌转化方法都依据 Mandel和Higa在 1970年的发 现,首先用冰预冷的CaCl2溶液处理细菌然后作短暂的热处 理 ,该处理方法改变了细胞膜的结构 , 在受体细胞中诱导了 一种短暂的“感受态” , 使质粒 DNA 能够穿过细菌细胞膜 进入细胞 , 因此 ,CaCl2 的浓度和热处理时间对质粒的转化 至关重要。用质粒转化大肠杆菌时 , 通常 CaCl2 浓度为 011mol/L,42 ℃ 热激 90s 。但在本试验中 , 当 CaCl2 浓度为 0.025mol/L,42℃热激3min时,转化频率最高。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• CaCl2浓度对转化频率的影响 • Ca2+在低温时可以使细胞壁的通透性及细胞表面的正 电荷增加,这些改变有利于DNA的吸附和吸收。本试验用 不同浓度的CaCl2即0.020,0.025,0.030和0.040mol/L处理 荧光假单胞菌细胞,结果表明,用0.025mol/L CaCl2处理荧 光假单胞菌细胞转化频率最高,0.040mol/L CaCl2处理转 化频率最低,随着CaCl2浓度的提高,转化频率呈现升高— 降低的变化趋势,浓度超过0.025mol/L时,转化频率急速下 降。
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 热激时间对转化频率的影响 • 本试验在42℃时分别处理1,2,3,4min,目的在于促进荧光 假单胞菌对DNA的吸收,热激时间直接影响转化子的形成, 结果表明,处理1,2min时,没有转化子形成,处理3,4min时,转 化频率较高
荧光假单胞菌工程菌株的构建
• 生长时期对转化频率的影响 • 细菌的生长时期直接影响感受态细胞的建立。取不同生长 时期的荧光假单胞菌,用0.025mol/LCaCl2处理进行转化, 结果表明,在OD约0.53时,转化频率最高,OD大于或小于 0.53时,转化频率均表现为下降趋势。