荧光假单胞杆菌的分离纯化

荧光假单胞杆菌的分离纯化

1.目的

1.1学习和掌握培养基的一般配置方法和步骤

1.2学习和掌握分离纯化技术的概念

1.3学习掌握涂布稀释分离微生物的技术

2.原理

2.1 由人工配置供给微生物生长繁殖代谢所需要的营养物质，称为培养基。含有氮源，碳源，无机离子，生长因子，水等物质，可分为固体，液体，半固体培养基。

2..2分离就是把成群的菌体一个一个地分开；

纯化就是进一步地分离，把菌种彻底分成当个菌体的技术。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

2.3荧光假单胞杆菌 (Pseudomonas fluorescens)

是一种常见的植物根际革兰氏阴性细菌, 是已知植物根际有益微生物中种群数量较多的细菌种类之一。该菌营养需要相对简单, 能够利用根系分泌物中大部分营养迅速在植物根围定殖。其中一些菌株具有促进植物生长和防治病害的作用, 是最具有应用前景的植物根围促生细菌 ( PGPR ) 之一，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。

3.材料试剂和器具

3.1试剂

3.1.1 金氏B(king medium B)培养基配方如下：

蛋白胨 20g，磷酸氢二钾 1.5g，硫酸镁 1.5g，琼脂 10g，无菌水1000ml。

pH值 7.2±0.2 。

3.1.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配方如下

蛋白胨 10g；牛肉浸粉 3g；氯化钠 5g；琼脂 13g；十六烷基三甲基溴化铵 0.3g；pH7.5± 0.1。

3.1.3器具

移液枪，试管，锥形瓶，量筒，天平，钥匙，剪刀，锡纸，标签纸，线绳，酒精灯，石棉网，借种环，培养皿等。

3.3材料番茄根部

4.操作步骤

4.1配制培养基

4.1.1金氏B(king medium B)培养基的配制

按培养基配方比例依次推确地称取蛋白胨 **，磷酸氢二钾 **g，硫酸镁 **g，放人盛有**无菌水的锥形瓶溶解。手摇锥型瓶使之完全溶解。溶解后定容至**ml。取出20ml于试管中盖好盖子，向锥型瓶是剩余的液体中加入**g琼脂加热溶解。

4.1.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配制

按培养基配方比例依次推确地称蛋白胨 **g；牛肉浸粉 **g；氯化钠 **g；；十六烷基三甲基溴化铵 **g；放人盛有**无菌水的锥形瓶溶解，定容至**ml。混合溶解后加入琼脂 **g加热溶化。

4.1.3灭菌

将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸气灭菌。

4.1.4倒平板

待其冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成平板。这次实验需要配制KB培养基16个，十六烷基三甲基溴化铵琼脂3

个。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管瓶塞(也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约 15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

4.1.4无菌捡查

将灭菌培养基放人=温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底

4.2荧光假单胞杆菌的分离

4.2.1 制备土壤稀释液

取番茄根部，抖落土壤，直至仅剩下粘连在根部的极少部分土壤即为本次实验的根际土。有酒精擦拭剪刀消毒，剪去根部，将带土的根部放入盛9ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，定容至10ml。振摇约20min，使根际土与水充分混合，将细胞分散。

4.2.2 涂布（在接种室或者超净工作台内进行）

在十六烷基三甲基溴化铵琼脂和KB平板底面分别用记号笔写上1、2 。取菌液1-2ml。小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

4.2.3 培养

将上述两个培养基置于20℃温室中培养1～2d。

4.2.4 挑菌落

将培养后挑选橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠,边缘整齐的菌落；再在紫外灯下进行经一步的挑选。（注：如果本次实验中如果出现整个平板菌落连成一片的情况，就需要稀释菌液10-100倍重复上述操作）用接种针，挑取少量的目的菌于试管的液体KB培养基中培养。

4.2.5 平板划线纯化

将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸取一环菌悬液，在平板一边划第一道平行线2-3。划完后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。转动培养皿70°，待环冷却后，从第一道线划过做第二次划线，同样方法，划出第三第四道平行线。

恒温培养：将划线平板倒置，于 28℃培养，1d后观察（若分离结果不理想，重复划线纯化，直到得到单一菌落）

4.3荧光假单胞杆菌的增殖培养

4.3.1涂布

取少量目的菌种于无菌水中，充分振摇。取菌液1-2ml。小心地滴在KB平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基.

4.3.2培养

置于28℃温室中培养1～2d。

5.注意事项

5.1称药品时，牛角匙不要混合用。。要根据不同的培养基注意不同的操作 5.2若配置液体培养基，不需要加入琼脂。

5.3分离纯化要在接种室或者超净工作台内进行。

5.4 制备无菌水时，要把容器的盖子松开，以免在灭菌过程中撑破试管。 5.5在高温蒸汽灭菌先排冷空气以让蒸汽充满整个高压锅。

5.4蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把钥匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。

附：平板划线操作