荧光假单胞杆菌的分离纯化
如何进行病原菌的分离
如何进行病原菌的分离如何进行病原菌的分离、纯培养材料用具菌种：米曲酶枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球白地霉蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus）酿酒酵母产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）培养基：淀粉琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基查氏琼脂培养基庖肉培养基肉汤培养基马铃薯培养基麦芽汁酵母膏培养基溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。
仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。
微生物的分离与纯化：一、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有1.简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
微生物的分离纯化方法
微生物的分离纯化方法微生物的分离纯化方法是微生物学研究的重要内容之一，旨在从混合的微生物群落中分离出单一种类的纯培养菌株。
微生物的纯化有助于研究其生物学特性、代谢途径以及应用领域等方面的深入研究。
下面将介绍常用的微生物分离纯化方法。
1. 单菌分离：是最常见的微生物分离方法之一。
通常使用传统方法（如分离培养基、落菌法、抗生素筛选等）以及现代分子生物学的技术手段（如16S rRNA 测序、荧光原位杂交等）对微生物进行筛选和分离，获得纯培养菌株。
2. 稀释平板法：是一种简单易行的微生物分离方法。
将待分离样品适当稀释后均匀涂布于富含适宜生长因子的平板培养基上，使微生物在固体培养基上形成单个菌落，然后用针头或者扩展环等工具将单个菌落接种于新的培养基上，形成纯培养单菌。
3. 滤膜方法：利用0.2μm以上的滤膜可以有效地将微生物和大颗粒物质分离开。
将待分离样品过滤，将滤膜放置于富含适宜生长因子的培养基上进行培养，从而获得纯菌落。
4. 凝胶去除法：主要针对混合微生物群落中细菌和其他微生物细胞凝胶的去除。
通过化学或物理方法（如酶解、超声波、渗透压等）将细胞凝胶分离离去，然后进行接种和培养，实现单菌分离纯化。
5. 选择性培养基法：利用特定的培养基，添加一定浓度的抗生素、染色剂或其他抑制物质限制其他微生物的生长，从而提高目标菌株的生长优势，实现单一种类的微生物分离纯化。
6. 微量稀释法：根据微生物的生长特性，将待分离样品进行多次连续稀释，然后分别在富含适宜生长因子的培养基上进行培养。
微生物的最高稀释度对应最大的菌落数目，可以通过对菌落的观察和计数，筛选到目标微生物。
7. 生物免疫法：利用微生物本身的免疫特性，通过制备抗体或其他免疫试剂对微生物进行分离纯化。
通过配对抗体和堆积生物试剂，将目标微生物从混合菌种中选择性地分离出来。
8. 流式细胞技术：是一种现代化的微生物分离纯化方法。
将待分离样品进行特定染色或标记，然后通过流式细胞仪对样品进行分析和排序，从而分离出目标微生物，实现单一种类微生物的分离纯化。
微生物纯培养—分离纯化方法汇总
微生物纯培养—分离纯化方法汇总含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（mixed culture）。
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（pureculture）。
在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。
１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
５、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
采用Hungate厌氧培养技术分离纯化光合细菌
利用 Ｈｕ ｇ ｔ ｎ ａｅ厌氧 培养 技 术 ， 克服 恃统 分离 光台 细菌 方法 的不 足 ， 是一 种快 。
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目前 ， 离纯 化 光 合细 菌 的方 法 甚 多 ， 常 分 但 除上 述 装 置外 还 需 注射 器 、 细 管 （ 的一 毛 粗
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光 合细 菌（ 红螺 菌科 ｐ ７０ 着 色菌 科 ｐ ．－ Ｈ ．； Ｈ８０
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（ ） 光 合细 菌 的 分 离： 将 溶化 好 的 装 有 固 １ ＃ 培 养基 的 厌 氧 管 置于 ４ — ５ ℃ 水浴 中 。 离 ｛ ： ５ ０ 分
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松材线虫携带的一株荧光假单胞细菌致萎毒素的初步分离
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关 键 词 ： 毒 素 ； 光 假 单 胞 菌 ； 材 线 虫 ；透 析 ； 光 显 微 生 测 法 荧 松 荧
中图 分 类 号 ：７３ １ ￥６ ．８ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ —７８ （０６ ０ —０ ７ 一ｏ １ １ ４ ８２０ ）１ ０ ５ ４ ０
Ｐ ｅｉ ｎ ｒ ａｔ ｉｎ ｏ ｈ ｏ ｉｓｏ ｔａｎｉ ｓｕ ｏ ｎ ｓｆ ｏ ｅｃ ｎ ｒｌ ｍｉａｙＰ ｒｉｏ ｆｔｅＴ ｘＩ ｆａＳｒｉ ｎ Ｐ ｅｄ ｍｏ ａ ｌ ｒｓｅｓ ｔ ｌ ｕ
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第４ ２卷 第 １ 期
２００６年 １月
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Ｊｎ， ａ ，２００６
松 材线 虫携带 的一株荧光假单胞 细菌 致萎毒素 的初步分 离
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怎样进行病原菌的分离
如何进行病原菌的分离、纯培养材料用具菌种：米曲酶 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球 白地霉 蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus）酿酒酵母产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）培养基：淀粉琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基查氏琼脂培养基庖肉培养基肉汤培养基马铃薯培养基麦芽汁酵母膏培养基溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。
仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。
微生物的分离与纯化：一、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有1.简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
菌株分离纯化的方法
菌株分离纯化的方法
嘿，你问菌株分离纯化的方法啊？这菌株分离纯化呢，就像是在一群小伙伴里找出最特别的那一个。
一种方法是平板划线法。
这就像在一块大蛋糕上用刀切出不同的小块。
先把含有各种菌株的混合物涂在平板上，然后用接种环在平板上划来划去。
每次划的时候，就会把一些菌株分开。
经过几次划线，就能在平板上长出一个个单独的菌落，这些菌落就是不同的菌株啦。
就好像一群小朋友在操场上玩，你用绳子把他们分成一个个小圈子，每个圈子里就是一个单独的小朋友。
还有稀释涂布法。
这就像把一大杯果汁倒在很多个小杯子里。
把含有菌株的混合物进行稀释，然后取一点稀释后的液体涂在平板上。
这样每个平板上的菌株就很少，经过培养，也能长出单独的菌落。
就像你把很多糖果撒在地上，然后一个一个地捡起来，每个糖果就是一个单独的菌株。
另外呢，还有单细胞分离法。
这就更厉害了，直接找出一个单独的细胞。
可以用显微镜观察，然后用微吸管把一个细胞吸出来。
这就像在一堆沙子里找出一颗特别的小石子。
举个例子哈，我有个朋友是学生物的。
他们要做一个实验，需要分离纯化一种特殊的菌株。
他们先用平板划线法，在平板上划了好几次，终于看到了一些单独的菌落。
但是还不确定是不是他们要的菌株。
然后他们又用稀释涂布法，在更多的平板上进行培养。
最后，他们用显微镜观察，找到了那个他们要的菌株。
他们可高兴了，说这就像找到了宝藏一样。
总之呢，菌株分离纯化的方法有平板划线法、稀释涂布法、单细胞分离法等等。
这些方法能帮助我们找到我们想要的菌株。
假单胞菌防治植物真菌性病害应用研究进展
假单胞菌的防治植物真菌性病害应用研究进展摘要：假单胞菌种类多、繁殖快。
它们能通过产生多种抗生素及有效的根际定殖防治植物病害,促进植物生长成为植物生防控制的重要研究对象。
本文主要论述了假单胞菌对植物真菌性病害生物防治应用的研究进展。
关键词：假单胞菌；PGRR；生防应用；植物病害Abstract Pseudomonas spp. is abundant and have a rapid reproduction, It can produce many kinds of antibiotics , rhizosphere colonization efficiently , promote the plant growth,in this way ,it become an important object in the study of biological control. This paper mainly discuss the biological control of Pseudomonas spp. in plant fungal disease.Key words Pseudomonad , PGPR , Biocontrol function；plant disease1 假单胞菌概况假单胞菌是一类直或微弯的杆菌，不呈螺旋状，没有菌柄也没有鞘，不产芽孢，需氧型，广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌。
它是植物根际较普遍的微生物类群之一，此类细菌的多数种类能产生株系具有拮抗或促生作用[1]。
现已证实假单胞菌能产生有效铁载体、抗生素、胞外水解酶和HCN等抑菌代谢产物，有效地保护植物根系免受病原微生物侵害[2]。
目前关于假单胞菌属的分类应用广泛的是pallernoi根据DNA-rRNA同源性研究提出的组群[3]。
其将假单胞菌分为20个种59个致病变种。
分为rRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五个同源群。
杨树解磷细菌蜡状芽孢杆菌和荧光假单胞菌发酵罐扩繁条件优化
７【 开 发 Ｉ
ｄｉ１ ． ９ ９ ｊｉ ｎ １０ － １ １２ １ ． １ ０ ２ ｏ：０ ３ ６ ／ ． ｓ ．０ ０ ８ ０ ． ０ ２ ０ ． ２ ｓ
杨 树解 磷 细 菌蜡 状 芽 孢 杆 菌 和 荧 光假 单胞 菌 发 酵 罐 扩繁 条 件 优 化
姚 如 斌 ， 小 芹 吴
菌的问题 。解磷细菌在实验室中大多采用摇瓶培养 ， 要将其大量扩繁必须从摇瓶到发酵罐上进行放大培 养 Ｊ 因此从 摇瓶培 养 到 发酵 罐 扩 繁是 发 酵 产 品 开 。
发 中 的一个非 常重 要 的环节 。因此 ， 本研 究拟 初步 探 讨杨 树 高效将 解 磷 细 菌 在 摇 瓶 发酵 的基 础 上 ， ３ 在 Ｌ 发 酵罐 中进行 发酵试 验 ， 以后 在 大 中型发酵 罐上 获 为
图 １和ｄ ｃ 是这两株解磷细菌在不同接种量下 ７ ２
ｈ内 ｐ 和溶氧量 的变化 趋势图 。ｐ 和溶氧量 的变 化 Ｈ Ｈ 与菌株生长 的状态 基 本一 致 ， 延滞 期 ｐ 在 Ｈ和 溶 氧量 基本保持不 变 ， 在对数期快速下 降并达 到最低 点 ， 稳 在 定期慢慢 回升 ， 最后 回到一个较 为稳定 的水平 。
得适合发酵罐发酵的工艺打下基础 。
１ 材 料与 方法
性磷的含量 。大量试验证实 ， Ｊ 向土壤 中施 用解磷
细 菌 ， 够增加 作 物磷素 吸 收量 ， 高作 物产 量 ， 大 能 提 并
１ １ 供 试 茵株 ． 杨树 根 际分离 纯化 获得 的两株 高效 解磷 细菌 ： 蜡 状 芽孢 杆 菌 Ｊ Ｚ— Ｄ Ｙ Ｓ １和 荧 光 假 单 胞 菌 Ｊ —Ｓ ｊ ｗ Ｊ１ 。
Ｋｅ ｏ ｄ ：ｈｓｈｔ ｓｌｂ ｉｎ ａｔ ｉ； ａｉｕ ｅ ｕ； ｓ ｄ ｍ ｎｓ ｕｒ ｃ，； ｅ ｅｔｔｎ ｙｗ ｒ ｓｐｏｐａｅ ｏ ｉｚ ｇ ｃ ｒ Ｂ ｃ ｌ ｃｒｓ Ｐｅ ｏ ｏ ａ ｏｅ ｅ ｆｒ ｎａｏ ｕ ｌｉ ｂ ｅａ ｌ ｓ ｅ ｕ ｌ ｆ ｓ ￣ ｍ ｉ Ａ ｔｏ ’ ｄ ｒｓ： ｏ ｅｅｏ ｏ ｓ Ｒ ｓｕｃｓａｄＥ ｖ ｏ ｍ ｎ， ａ ｎ ｏｅｔ ｎ ｅｓｙ ａ ｎ １０ ７ ｈｎ ｕｈ ｒ Ｓ ｄ ｅｓ Ｃ ｌｇ ｆ ｒ ｔ ｅｏｒｅ ｎ ｎｉ ｎ ｅｔＮ ｍｉｇＦｒｓ ｙＵ ｉ ｒ ｔ，Ｎ ｍｉｇ ３ ，Ｃ ｉａ ａ ｌ Ｆ ｅ ｒ ｒ ｖ ｉ ２０
光合细菌菌种的分离_富集培养_纯化和菌种鉴定及净化水质的研究
对照不加菌液 - 毫升 ( 升菌液 #" 毫升 ( 升菌液 #- 毫升 ( 升菌液 !" 毫升 ( 升菌液
总之，从以上 + 种菌种单一的培养液净化水质的 且效果好； 加 效果来看， 加入量以 #" 4 #" 5 . 为最经济， 入 量 #- 4 #" 5 . 和 !" 4 #" 5 . 虽 然 效 果 更 好 ， 但 成 本 高。 从单一菌株净化水质的效果看， 沼泽红假单胞菌效 果最好， 其次为胶质红、 球形红和绿色红假单胞菌。
表.
组份
多菌种净化水质效果
%2+ / 毫克 3 升 0 !#, *" #*, "1 #-, -# 氨氮含量 / 毫克 3 升 0 #, #" ", -# ", .1 亚硝酸盐 / 毫克 3 升 0 ", -$ ", 1" ", )(
", #1 毫 克 3 升 ， 至 试 验 !" 天 后 升 至 ", (1 毫克 3 升，而试验池至 !" 天后氨
*+(,- # 克，./,-! ") ! 克，酵母膏 ! 克，0! +12( 琼脂 !" 克， 水 4"" 毫升。 ") % 克， *3,- ! 克，
荧光假单胞杆菌胞外蛋白酶的纯化及热稳定性
素有 关 Ｊ ．为研 究原料 乳 中荧光 假单胞 菌蛋 白酶 与 热稳 定 性 之 间 的关 系 ， 荧 光假 单 胞 菌 Ｒ ２发 从 ｍｌ 酵液 中分离 纯化 了蛋 白酶 Ｈ ｌ ， 对其性 质进 行 了鉴定 ． ｔ２ 并
１ 实 验部 分
１ １ 试 剂 与仪器 ．
荧 光假 单胞 菌 Ｒ ２ 从 原 料乳 中分 离 获得 ） 偶 氮 酪蛋 白（ ｉ —ｌｒｈ公 司 ） ｍｌ （ ； Ｓｇ Ａｄｉ ｍａ ｃ ；电泳 Ｍａ ｅ，分 ｒｒ ｋ
中图分类号
荧光假 单胞 菌是 低温 冷藏 原料乳 中常见 的一类 嗜冷 菌 ．这类 微 生物 本 身不 耐 热 ， 般 巴 氏杀菌 一
可 以将其 杀死 ， 其分 泌 的胞外 耐热性 蛋 白酶可 以耐受 Ｕ Ｔ杀 菌条件 （４ Ｃ， ） 但 Ｈ １０ｑ ４Ｓ而存 活 ， 常引起 经 Ｕ Ｔ乳 及其它 乳制 品在 货架期 内发 生水 解 、 块 和变苦 等 品质劣 变现 象 ， 以研究 荧光 假 单胞 菌 耐 Ｈ 凝 所 热性 蛋 白酶 十分 重要 ．研 究结果 表 明 ， 白酶 的热 稳定 性 与 氨基 酸组 成 、二硫 键 和金 属 离 子 等多 种 因 蛋
子排阻层析 Ｍ ｒ ｒＳ ｍ —ｌ ｉ ａ ｅ（ ｉ ａ ｄ ｃ ｋ ｇ Ａ ｒ ｈ公司） Ｄ Ａ —ｅｈｒ ｅＦｓ Ｆ ｗ树脂 ， ｈｎｌ ｅｈｒ ｅＦｓ Ｆ ｗ ； Ｅ ＥＳｐａ ｓ ａｔ ｌ ｏ ｏ Ｐ ｅｙ Ｓｐａ ｓ ａ ｌ — ｏ ｔ ｏ 树 脂 （ ｈｒ ｃａ公 司 ） ｕ ｅｄｘ２ ０ ＨＲ树 脂 （ Ｅ Ｈ ａ ｈ ａｅ公 司 ） Ｐａ ｍａｉ ；Ｓ ｐ ｒｅ ０ Ｇ ｅｈ ｃｒ ．紫 外 可 见 分 光 光 度 仪 Ｄ ８ ０ Ｕ ０ （ ｅｋ ｎ公 司 ） 低温 高速 离心机 Ｈｍａ Ｆ１ Ｒ Ｈ Ｔ Ｃ 公 司 ） ＢｏＲ ｄ Ｂｏｏｉ Ｌ Ｂ ｃｍａ ； ｉ ｃＣ ５ （ ＩＡ ＨＩ ； ｉ— ａ ｉ ｇｃ Ｐ常压 生 物层 析 ｌ
荧光假单胞菌毒蛋白的分离纯化与松材线虫的无异培养
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三年来．作者在求知建路上取得的成绩，元不１董注蕾导师大量的心血：导师严蕾的治掌的态度、博大的朐豢、诲人不俘的精神和为■师裹的离尚品格．使掌生杀受教蓝并将铭记于心。
在生活中．导师和捌秀年老朋分予了无截不至的关怀．使掌生得以曩利完成掌业。
在论文研兜过程中．南京替生大掌囊疆羲研氲的韩羹芬教蔓、韩正羲教攫：化工院的越＃果捌教攫、毛连山老师：车敦研究室的来ｌ博士后、制●博士后和糟曩饨博士对研兜方案撮出了空量意见．并给予了热情的指导。
荧光假单胞杆菌AbⅢ745-6抑菌物质分离纯化和结构鉴定
（ ． 北 农 林 科 技 大 学 植 保学 院 与陕 西 省农 业 分 子 生 物 学 重 点 实 验 室 ， 西 杨 凌 １西 陕 ７ ２０ ２ 陕西 海 浪生 物 研 究 所 ， 西 西 安 １１０；． 陕
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罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定_邓显文
收稿日期：2010－01－13基金项目：广西科技攻关项目（桂科攻0428001－2）作者简介：邓显文（1963－），男，广西贺州人，副研究员，主要从事动物疫病分子生物学研究工作。
*为通信作者：E－mail ：xiezhixun＠126．com 。
荧光假单胞菌（Pseudomonas fluoroscens ）是淡水鱼类赤皮病的主要病原菌，为革兰氏阴性菌［1］。
草鱼、青鱼、鲤鱼、鲫鱼等大多数淡水鱼类均可感染，发病范围广，在我国各养殖水域均有流行；一年四季均可发病，且死亡率较高，尤其在鱼类运输、捕捞或放养时，鱼体一旦受到机械损伤或越冬冻伤，更易引发此病［2～4］，给我国淡水养殖业造成严重经济损失。
2008年6月，广西某水库网箱养鱼场的罗非鱼突然发病、死亡，每天每网箱约有10尾死亡。
罗非鱼患病初期，头部、各鳍条被白色粘液物覆盖，随病情加重，白色粘液物逐渐蔓延至全身，整个体表被一层白膜覆盖，严重时体表出血发炎、鳞片松散脱落，鳍基部充血、鳍条充血或糜烂呈扫帚状，眼球突出、浑浊发白，有的病鱼眼球脱落、靠近网箱溜边，不吃食，游动缓慢，不久死亡［5～7］。
从病鱼体内分离获得1株致病菌株，经形态培养、生理生化鉴定、动物试验及PCR 检测、克隆测序、Blast 比对分析，鉴定为荧光假单胞菌；同时还进行药敏试验，以期为今后更好地防治该病提供参考依据。
1材料与方法1．1病原菌分离培养无菌采取发病或濒死罗非鱼的肝脏、鳞片脱落处或鳍条糜烂处，划线接种于血斜培养基和普通琼脂培养基上，30℃培养24～48h ，分离病原菌。
1．2形态特征鉴定观察普通琼脂培养基上的菌落形态，革兰氏染色、荚膜染色、镜检。
取纯化的分离菌株培养物，接种于羊血琼脂培养基上，30℃培养24h ，观察溶血罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定邓显文，谢芝勋*，刘加波，谢志勤，谢丽基，庞耀珊（广西兽医研究所，南宁530001）摘要：从发病罗非鱼中分离获得1株革兰氏阴性杆菌，依据细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为荧光假单胞菌，结合PCR 检测、克隆测序及Blast 比对分析，进一步确定该分离菌株为荧光假单胞菌。
荧光假单胞杆菌的分离纯化1
荧光假单胞杆菌的分离纯化1.目的1.1学习和掌握培养基的一般配置方法和步骤1.2学习和掌握分离纯化技术的概念1.3学习掌握涂布稀释分离微生物的技术2.原理2.1 由人工配置供给微生物生长繁殖代谢所需要的营养物质，称为培养基。
含有氮源，碳源，无机离子，生长因子，水等物质，可分为固体，液体，半固体培养基。
2..2分离就是把成群的菌体一个一个地分开；纯化就是进一步地分离，把菌种彻底分成当个菌体的技术。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
2.3荧光假单胞杆菌 (Pseudomonas fluorescens)是一种常见的植物根际革兰氏阴性细菌, 是已知植物根际有益微生物中种群数量较多的细菌种类之一。
该菌营养需要相对简单, 能够利用根系分泌物中大部分营养迅速在植物根围定殖。
其中一些菌株具有促进植物生长和防治病害的作用, 是最具有应用前景的植物根围促生细菌 ( PGPR ) 之一，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。
3.材料试剂和器具3.1试剂3.1.1金氏B(king medium B)培养基配方如下：蛋白胨 20g，磷酸氢二钾 1.5g，硫酸镁 1.5g，琼脂 10g，无菌水1000ml。
pH值 7.2±0.2 。
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荧光假单胞杆菌的分离纯化
1.目的
1.1学习和掌握培养基的一般配置方法和步骤
1.2学习和掌握分离纯化技术的概念
1.3学习掌握涂布稀释分离微生物的技术
2.原理
2.1 由人工配置供给微生物生长繁殖代谢所需要的营养物质，称为培养基。
含有氮源，碳源，无机离子，生长因子，水等物质，可分为固体，液体，半固体培养基。
2..2分离就是把成群的菌体一个一个地分开；
纯化就是进一步地分离，把菌种彻底分成当个菌体的技术。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
2.3荧光假单胞杆菌 (Pseudomonas fluorescens)
是一种常见的植物根际革兰氏阴性细菌, 是已知植物根际有益微生物中种群数量较多的细菌种类之一。
该菌营养需要相对简单, 能够利用根系分泌物中大部分营养迅速在植物根围定殖。
其中一些菌株具有促进植物生长和防治病害的作用, 是最具有应用前景的植物根围促生细菌 ( PGPR ) 之一，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。
3.材料试剂和器具
3.1试剂
3.1.1 金氏B(king medium B)培养基配方如下：
蛋白胨 20g，磷酸氢二钾 1.5g，硫酸镁 1.5g，琼脂 10g，无菌水1000ml。
pH值 7.2±0.2 。
3.1.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配方如下
蛋白胨 10g；牛肉浸粉 3g；氯化钠 5g；琼脂 13g；十六烷基三甲基溴化铵 0.3g；pH7.5± 0.1。
3.1.3器具
移液枪，试管，锥形瓶，量筒，天平，钥匙，剪刀，锡纸，标签纸，线绳，酒精灯，石棉网，借种环，培养皿等。
3.3材料番茄根部
4.操作步骤
4.1配制培养基
4.1.1金氏B(king medium B)培养基的配制
按培养基配方比例依次推确地称取蛋白胨 **，磷酸氢二钾 **g，硫酸镁 **g，放人盛有**无菌水的锥形瓶溶解。
手摇锥型瓶使之完全溶解。
溶解后定容至**ml。
取出20ml于试管中盖好盖子，向锥型瓶是剩余的液体中加入**g琼脂加热溶解。
4.1.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配制
按培养基配方比例依次推确地称蛋白胨 **g；牛肉浸粉 **g；氯化钠 **g；；十六烷基三甲基溴化铵 **g；放人盛有**无菌水的锥形瓶溶解，定容至**ml。
混合溶解后加入琼脂 **g加热溶化。
4.1.3灭菌
将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸气灭菌。
4.1.4倒平板
待其冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成平板。
这次实验需要配制KB培养基16个，十六烷基三甲基溴化铵琼脂3
个。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管瓶塞(也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。
如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。
左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约 15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4.1.4无菌捡查
将灭菌培养基放人=温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底
4.2荧光假单胞杆菌的分离
4.2.1 制备土壤稀释液
取番茄根部，抖落土壤，直至仅剩下粘连在根部的极少部分土壤即为本次实验的根际土。
有酒精擦拭剪刀消毒，剪去根部，将带土的根部放入盛9ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，定容至10ml。
振摇约20min，使根际土与水充分混合，将细胞分散。
4.2.2 涂布（在接种室或者超净工作台内进行）
在十六烷基三甲基溴化铵琼脂和KB平板底面分别用记号笔写上1、2 。
取菌液1-2ml。
小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。
用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。
室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。
4.2.3 培养
将上述两个培养基置于20℃温室中培养1～2d。
4.2.4 挑菌落
将培养后挑选橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠,边缘整齐的菌落；再在紫外灯下进行经一步的挑选。
（注：如果本次实验中如果出现整个平板菌落连成一片的情况，就需要稀释菌液10-100倍重复上述操作）用接种针，挑取少量的目的菌于试管的液体KB培养基中培养。
4.2.5 平板划线纯化
将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸取一环菌悬液，在平板一边划第一道平行线2-3。
划完后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。
转动培养皿70°，待环冷却后，从第一道线划过做第二次划线，同样方法，划出第三第四道平行线。
恒温培养：将划线平板倒置，于 28℃培养，1d后观察（若分离结果不理想，重复划线纯化，直到得到单一菌落）
4.3荧光假单胞杆菌的增殖培养
4.3.1涂布
取少量目的菌种于无菌水中，充分振摇。
取菌液1-2ml。
小心地滴在KB平板培养基表面中央位置。
用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。
室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基.
4.3.2培养
置于28℃温室中培养1～2d。
5.注意事项
5.1称药品时，牛角匙不要混合用。
要根据不同的培养基注意不同的操作 5.2若配置液体培养基，不需要加入琼脂。
5.3分离纯化要在接种室或者超净工作台内进行。
5.4 制备无菌水时，要把容器的盖子松开，以免在灭菌过程中撑破试管。
5.5在高温蒸汽灭菌先排冷空气以让蒸汽充满整个高压锅。
5.4蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
另外，称药品时严防药品混杂，一把钥匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。
瓶盖也不要盖错。
附：平板划线操作。