细胞培养技术实用篇
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。 而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、 子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效．但若与胶原 酶合用能增加其对组织的分离作用 。 钙镁离子和血清抑制其活性。 常用剂量为0.25%，PH8，温度37℃
细胞培养技术实用篇
胶原酶法（collagenase）
水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影 响不大。
局限性
细胞培养技术实用篇
人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和
细胞相互间的影响 体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环
境中，必然发生变化。
本章主要内容
细胞培养技术实用篇
细胞培养的基本操作技术 原代培养(primary culture) 传代培养(subculture) 体外培养细胞的影响因素 细胞培养污染及对策 培养细胞的生长测定方法 细胞冻存和复苏
在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污
染机会。
消毒
细胞培养技术实用篇
地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布 要专用)，紫外线照射消毒30-50min
超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然 后紫外线消毒30min。
消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠 放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。
细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代 成功后即为细胞系
细胞培养技术实用篇
细胞培养中的常用术语
细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法 从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标 志的培养物称细胞株。
汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底 物面积。
细胞培养(Cell Culture)： 培养物是单个细胞 和细胞群。
细胞培养技术实用篇
细胞培养中Baidu Nhomakorabea常用术语
原代培养（primary culture）：从体内取出细 胞或组织的第一次培养。
传代（passage）也称再培养。无论是否稀释， 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶 即称为传代或传代培养。也称再培养。
用火焰烧灼消毒或取备品更换。
细胞培养技术实用篇
组织细胞取材及培养的基本要求
取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。 取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量
去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链 霉素和制霉菌素漂洗。 原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的 培养液。 一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低 的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易 培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养 与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标 本，对供体来源、部位及一般情况做记录。
密度梯度离心法： 用离心法将细胞分到不同 密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适 于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。
细胞培养技术实用篇
胰蛋白酶（Trypsin）
对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。 消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与
硬度有关。 适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离
细胞生物学技术
细胞培养技术实用篇
第三章 细胞培养基本技术
细胞培养的优点
细胞培养技术实用篇
活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形 态、结构和生命活动
可控制：
选择特定的细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等 可采用各种研究技术、记录方法
样品均一性：来源于同一组织同一种细胞 经济、规模
组织材料的分离
细胞培养技术实用篇
机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、 胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆 器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。
化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法 细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离
心法
细胞培养技术实用篇
细胞悬液的分离方法
低速离心法： 血液和体液等细胞悬液5001000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过 长，会造成细胞损伤和死亡。
火焰消毒
细胞培养技术实用篇
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先 要点燃酒精灯。
按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近 处并经过烧灼进行。
如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞， 以防烧死细胞。
操作
细胞培养技术实用篇
进行培养时，动作要准确敏捷 不能太快，否则空气流动增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要
接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互 接触后失去运动的现象
细胞培养技术实用篇
一、细胞培养基本操作技术
由于体外培养的 细胞没有抗感染能力， 因此防污染是决定培 养成功的首要条件。 一切操作需要保证 无菌和有条不紊。
培养前准备
细胞培养技术实用篇
制定好实验计划和操作程序 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置
细胞培养技术实用篇
细胞培养中的常用术语
组织培养(Tissue Culture)： 指的是从体内取 出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并 维持其结构和功能的方法。
器官培养（Organ Culture）： 培养的是器官的 原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生 存、生长和保持一定功能的方法。
一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架 等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
洗手和着装
细胞培养技术实用篇
原则上和外科手术相同。 仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外
线照射30min的清洁工作服 在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着
长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消 毒手。 进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 专用鞋或带鞋套
产品有Ⅳ Ⅶ Ⅸ等型，分别适用于分离肝细胞、 胰岛、脂肪细胞及纤维组织。
钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7 常用剂量为200U/ml
细胞培养技术实用篇
胶原酶法（collagenase）
水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影 响不大。
局限性
细胞培养技术实用篇
人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和
细胞相互间的影响 体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环
境中，必然发生变化。
本章主要内容
细胞培养技术实用篇
细胞培养的基本操作技术 原代培养(primary culture) 传代培养(subculture) 体外培养细胞的影响因素 细胞培养污染及对策 培养细胞的生长测定方法 细胞冻存和复苏
在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污
染机会。
消毒
细胞培养技术实用篇
地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布 要专用)，紫外线照射消毒30-50min
超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然 后紫外线消毒30min。
消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠 放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。
细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代 成功后即为细胞系
细胞培养技术实用篇
细胞培养中的常用术语
细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法 从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标 志的培养物称细胞株。
汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底 物面积。
细胞培养(Cell Culture)： 培养物是单个细胞 和细胞群。
细胞培养技术实用篇
细胞培养中Baidu Nhomakorabea常用术语
原代培养（primary culture）：从体内取出细 胞或组织的第一次培养。
传代（passage）也称再培养。无论是否稀释， 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶 即称为传代或传代培养。也称再培养。
用火焰烧灼消毒或取备品更换。
细胞培养技术实用篇
组织细胞取材及培养的基本要求
取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。 取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量
去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链 霉素和制霉菌素漂洗。 原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的 培养液。 一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低 的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易 培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养 与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标 本，对供体来源、部位及一般情况做记录。
密度梯度离心法： 用离心法将细胞分到不同 密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适 于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。
细胞培养技术实用篇
胰蛋白酶（Trypsin）
对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。 消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与
硬度有关。 适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离
细胞生物学技术
细胞培养技术实用篇
第三章 细胞培养基本技术
细胞培养的优点
细胞培养技术实用篇
活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形 态、结构和生命活动
可控制：
选择特定的细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等 可采用各种研究技术、记录方法
样品均一性：来源于同一组织同一种细胞 经济、规模
组织材料的分离
细胞培养技术实用篇
机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、 胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆 器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。
化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法 细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离
心法
细胞培养技术实用篇
细胞悬液的分离方法
低速离心法： 血液和体液等细胞悬液5001000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过 长，会造成细胞损伤和死亡。
火焰消毒
细胞培养技术实用篇
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先 要点燃酒精灯。
按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近 处并经过烧灼进行。
如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞， 以防烧死细胞。
操作
细胞培养技术实用篇
进行培养时，动作要准确敏捷 不能太快，否则空气流动增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要
接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互 接触后失去运动的现象
细胞培养技术实用篇
一、细胞培养基本操作技术
由于体外培养的 细胞没有抗感染能力， 因此防污染是决定培 养成功的首要条件。 一切操作需要保证 无菌和有条不紊。
培养前准备
细胞培养技术实用篇
制定好实验计划和操作程序 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置
细胞培养技术实用篇
细胞培养中的常用术语
组织培养(Tissue Culture)： 指的是从体内取 出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并 维持其结构和功能的方法。
器官培养（Organ Culture）： 培养的是器官的 原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生 存、生长和保持一定功能的方法。
一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架 等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
洗手和着装
细胞培养技术实用篇
原则上和外科手术相同。 仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外
线照射30min的清洁工作服 在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着
长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消 毒手。 进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 专用鞋或带鞋套
产品有Ⅳ Ⅶ Ⅸ等型，分别适用于分离肝细胞、 胰岛、脂肪细胞及纤维组织。
钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7 常用剂量为200U/ml