色谱质谱联用 高效液相色谱法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
H = A + B/u + C u
4
与经典液相相比，HPLC具有以下特点：
柱效高； 分离速度快； 分离效果好； 检测灵敏度高； 自动化程度高
5
特点 ①柱效高 HPLC首先使用了细颗粒(5~10μm，而经典液相色谱
法为150~220μm)、高效率的固定相和均匀填充技术， 从而使HPLC具备了新型高效的色谱分离柱，柱效可 高达每米105理论塔板。
动机带动凸轮或齿轮转动，驱动柱塞在液缸内往复运动， 将流动相源源不断地输送到色谱柱。
▪ 往复柱塞泵的液缸容积小，可小至0.1ml，因此易于清洗
和更换流动相，特别适合于梯度洗脱。
▪ 往复泵输液有脉动，常用两个泵头，并加脉冲阻尼器以
克服脉动。
22
输液泵的维护和使用注意事项
(1)流动相中应不含任何固体微粒 原因：尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损
8
④自动化程度高 HPLC仪器采用了先进的计算机技术，使
HPLC整个系统的运行、操作都受计算机 控制(色谱工作站)。
9
HPLC与GC相比较，具有以下优点
１．应用范围广 GC的分析对象
足够挥发性 热稳定性
HPLC的分析对象
HPLC具有更广的应用范围，对于不能用GC分离 分析的高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机 化合物及多种离子，都可用HPLC进行分离分析。
柱塞，密封圈、缸体和单向阀；同时会堵 塞色谱柱。 对策a:流动相要采用HPLC级溶剂，水为双 蒸水。 采用滤膜(0.2μm或0.45μm)滤过，流动 相最好在使用前新配制。（有机相：尼龙 膜，水相：纤维素膜）
23
对策b：防止缓冲盐析出 含有缓冲液的流动相停泵前必须将缓冲盐流动相清洗
（95%水+5%甲醇），再换成适合于色谱柱保存和有利 于泵维护的溶剂（100%甲醇）。 缓冲盐体系不得直接更改至高有机相比例体系。 经常用水清洗泵头
10
2．易于实现制备 HPLC的洗脱液容易
收集，所以HPLC除了 用于分离分析外，还 可用于分离制备。
11
HPLC与GC相比较，具有以下不足之处 缺乏通用型的高灵敏度检测器(目前常用的灵敏度较高
的紫外、荧光检测器都是选择性检测器)； 仪器比较复杂、昂贵；柱和流动相的消耗成本高； 流动相含有大量有机溶剂，对环境和操作人员有影响。 所以，对于既能用GC也能用HPLC测定的物质，一般还
H = A + B/u + C u
6
②分离速度快、分离效果好 由于HPLC采用了细颗粒的固定相，使传统的依靠
重力输液的方法彻底不可行，HPLC法中采用了高 压泵输送流动相，使分离速度大大提高； 通常的工作压力为几十~ 400大气压
7
③灵敏度高 HPLC采用了高灵敏的检测器，
将检测器接在柱后直接检测洗 脱的各组分，根据组分的特性 可采用紫外、荧光、电化学等 不同检测器，最小检测量可达 10-9~10-11g。
26
(4) 泵内产生气泡，造成压力波动，影响流量的稳定性。 气泡还会影响色谱柱的分离效率和检测器的灵敏度， 以及基线稳定性。
27
对策：流动相脱气 超声脱气法 通氦脱气法 抽真空法 加热法 在线脱气
28
(二)梯度洗脱装置
高效液相色谱有两种洗脱方式： 等度洗脱(isocratic elution)：在同一分析周期内，流 动相组成始终保持恒定的洗脱方法，又称为等度洗脱、恒 组成溶剂洗脱。 梯度洗脱（gradient elution ）：按照一定的时间程序， 连续或阶段性地改变流动相中各溶剂的配比，以达到改变 流动相极性、离子强度或pH值，从而提高洗脱能力、改 善分离的一种洗脱方法。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
公共卫生学院卫生检验系 张晓玲
概述
特点
高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC) 是60年代末在经典液相色谱法的基础上， 应用在气相色谱实践中发展起来的色谱 理论，建立并发展起来的一种新型分离 分析技术。
2
在经典液相色谱中，由于使 用粗颗粒的固定相，填充不 均匀，使分离的柱效低；依 靠重力使流动相流动，使分 析速度慢，且自动化程度低。
3
60年代，Giddings等人将气相色谱 中的塔板理论和速率理论应用于液 相色谱领域。按照速率理论，要减 少涡流扩散对柱效的影响，应使固 定相的颗粒细，大小均匀，并且填 充均匀。所以，通过改进固定相性 质，并进而改变流动相的输送方式， 就产生了HPLC。
高效液相色谱的流动相是通过高压输液泵来输 送的，泵的性能好坏直接影响整个高效液相色谱仪 的质量和分析结果的可靠性。
20
百度文库
输液泵应具备如下性能： 流量稳定 输出压力高 流量范围宽 液缸（泵室）容积小 密封性能好，耐腐蚀 压力平稳，波动小
21
▪ 目前在恒流泵中应用最多的是柱塞往复泵，通常是由电
是用GC法更适当些。
12
应用
药物研究领域
药物质量控制：含量测定；杂质、分解产物和微量成分的测定。 药物研究开发，还用于 药物代谢产物的分析、鉴定及临床治疗药物的监测。
临床医学研究：对蛋白质、多肽、酶、激素等的分析和研究。 卫生、食品、环境等领域
食品添加剂检测无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪 酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多 核芳烃、食品安全、环境中污染物分析
24
(2)泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空 泵运转也磨损柱塞和缸体或密封圈，最终产生漏液。
对策：设置最低系统压力10kg/cm2
25
(3)输液泵的工作压力绝不要超过规定的最高压力，否则会 使高压密封环变形，产生漏液，同时有可能造成柱塌陷 损坏色谱柱。
对策：设置最高系统压力 300kg/cm2
13
高效液相色谱仪
14
15
高效液相色谱仪
一般高效液相色谱仪由五个部分组成 高压输液系统（泵） 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
16
高效液相色谱仪
17
HPLC仪器示意图
一、高压输液系统
贮液装置 高压输液泵 过滤器 脱气装置 压力脉动阻滞器 梯度洗脱装置
19
(一)高压输液泵(high pressure pump)
4
与经典液相相比，HPLC具有以下特点：
柱效高； 分离速度快； 分离效果好； 检测灵敏度高； 自动化程度高
5
特点 ①柱效高 HPLC首先使用了细颗粒(5~10μm，而经典液相色谱
法为150~220μm)、高效率的固定相和均匀填充技术， 从而使HPLC具备了新型高效的色谱分离柱，柱效可 高达每米105理论塔板。
动机带动凸轮或齿轮转动，驱动柱塞在液缸内往复运动， 将流动相源源不断地输送到色谱柱。
▪ 往复柱塞泵的液缸容积小，可小至0.1ml，因此易于清洗
和更换流动相，特别适合于梯度洗脱。
▪ 往复泵输液有脉动，常用两个泵头，并加脉冲阻尼器以
克服脉动。
22
输液泵的维护和使用注意事项
(1)流动相中应不含任何固体微粒 原因：尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损
8
④自动化程度高 HPLC仪器采用了先进的计算机技术，使
HPLC整个系统的运行、操作都受计算机 控制(色谱工作站)。
9
HPLC与GC相比较，具有以下优点
１．应用范围广 GC的分析对象
足够挥发性 热稳定性
HPLC的分析对象
HPLC具有更广的应用范围，对于不能用GC分离 分析的高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机 化合物及多种离子，都可用HPLC进行分离分析。
柱塞，密封圈、缸体和单向阀；同时会堵 塞色谱柱。 对策a:流动相要采用HPLC级溶剂，水为双 蒸水。 采用滤膜(0.2μm或0.45μm)滤过，流动 相最好在使用前新配制。（有机相：尼龙 膜，水相：纤维素膜）
23
对策b：防止缓冲盐析出 含有缓冲液的流动相停泵前必须将缓冲盐流动相清洗
（95%水+5%甲醇），再换成适合于色谱柱保存和有利 于泵维护的溶剂（100%甲醇）。 缓冲盐体系不得直接更改至高有机相比例体系。 经常用水清洗泵头
10
2．易于实现制备 HPLC的洗脱液容易
收集，所以HPLC除了 用于分离分析外，还 可用于分离制备。
11
HPLC与GC相比较，具有以下不足之处 缺乏通用型的高灵敏度检测器(目前常用的灵敏度较高
的紫外、荧光检测器都是选择性检测器)； 仪器比较复杂、昂贵；柱和流动相的消耗成本高； 流动相含有大量有机溶剂，对环境和操作人员有影响。 所以，对于既能用GC也能用HPLC测定的物质，一般还
H = A + B/u + C u
6
②分离速度快、分离效果好 由于HPLC采用了细颗粒的固定相，使传统的依靠
重力输液的方法彻底不可行，HPLC法中采用了高 压泵输送流动相，使分离速度大大提高； 通常的工作压力为几十~ 400大气压
7
③灵敏度高 HPLC采用了高灵敏的检测器，
将检测器接在柱后直接检测洗 脱的各组分，根据组分的特性 可采用紫外、荧光、电化学等 不同检测器，最小检测量可达 10-9~10-11g。
26
(4) 泵内产生气泡，造成压力波动，影响流量的稳定性。 气泡还会影响色谱柱的分离效率和检测器的灵敏度， 以及基线稳定性。
27
对策：流动相脱气 超声脱气法 通氦脱气法 抽真空法 加热法 在线脱气
28
(二)梯度洗脱装置
高效液相色谱有两种洗脱方式： 等度洗脱(isocratic elution)：在同一分析周期内，流 动相组成始终保持恒定的洗脱方法，又称为等度洗脱、恒 组成溶剂洗脱。 梯度洗脱（gradient elution ）：按照一定的时间程序， 连续或阶段性地改变流动相中各溶剂的配比，以达到改变 流动相极性、离子强度或pH值，从而提高洗脱能力、改 善分离的一种洗脱方法。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
公共卫生学院卫生检验系 张晓玲
概述
特点
高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC) 是60年代末在经典液相色谱法的基础上， 应用在气相色谱实践中发展起来的色谱 理论，建立并发展起来的一种新型分离 分析技术。
2
在经典液相色谱中，由于使 用粗颗粒的固定相，填充不 均匀，使分离的柱效低；依 靠重力使流动相流动，使分 析速度慢，且自动化程度低。
3
60年代，Giddings等人将气相色谱 中的塔板理论和速率理论应用于液 相色谱领域。按照速率理论，要减 少涡流扩散对柱效的影响，应使固 定相的颗粒细，大小均匀，并且填 充均匀。所以，通过改进固定相性 质，并进而改变流动相的输送方式， 就产生了HPLC。
高效液相色谱的流动相是通过高压输液泵来输 送的，泵的性能好坏直接影响整个高效液相色谱仪 的质量和分析结果的可靠性。
20
百度文库
输液泵应具备如下性能： 流量稳定 输出压力高 流量范围宽 液缸（泵室）容积小 密封性能好，耐腐蚀 压力平稳，波动小
21
▪ 目前在恒流泵中应用最多的是柱塞往复泵，通常是由电
是用GC法更适当些。
12
应用
药物研究领域
药物质量控制：含量测定；杂质、分解产物和微量成分的测定。 药物研究开发，还用于 药物代谢产物的分析、鉴定及临床治疗药物的监测。
临床医学研究：对蛋白质、多肽、酶、激素等的分析和研究。 卫生、食品、环境等领域
食品添加剂检测无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪 酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多 核芳烃、食品安全、环境中污染物分析
24
(2)泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空 泵运转也磨损柱塞和缸体或密封圈，最终产生漏液。
对策：设置最低系统压力10kg/cm2
25
(3)输液泵的工作压力绝不要超过规定的最高压力，否则会 使高压密封环变形，产生漏液，同时有可能造成柱塌陷 损坏色谱柱。
对策：设置最高系统压力 300kg/cm2
13
高效液相色谱仪
14
15
高效液相色谱仪
一般高效液相色谱仪由五个部分组成 高压输液系统（泵） 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
16
高效液相色谱仪
17
HPLC仪器示意图
一、高压输液系统
贮液装置 高压输液泵 过滤器 脱气装置 压力脉动阻滞器 梯度洗脱装置
19
(一)高压输液泵(high pressure pump)