酶与微生物细胞的固定化

2013-8-20
24
优点：此法制得的固定化酶，酶分子和载体间的
共价键较牢固，在介质组成发生改变和进行反应
时，都不会造成酶的脱落，因而可以反复使用。
缺点：制取固定酶较复杂，反应条件比较剧烈， 所以要制得酶活力很高的固定化酶较为困难。 制作方法：有重氮化法、烷基化和芳基化法、肽 法和戊二醛法等。
2013-8-20
Aminoacylase
氨基酰化酶
2013-8-20 28
A-L-Ala A-D-Ala
固定化酶 柱子 离心机
泵 储 罐 反应产物
L-Ala A-D-Ala
消 旋 反 应 器
晶体 L-Ala
可以使生产过程连续化，其次它还可以使生产过
程自动化，降低劳动强度，又提高生产效率，使
成本大大降低。
2、固定化多酶反应
别是需要辅酶的反应。而第二类固定化细胞通
常用于由一种辅酶或少数几种酶催化的反应。
2013-8-20 40
（5）固定化细胞的应用 生产L-氨基酸、L-苹果酸 生产果葡糖浆 生产6-APA和抗生素 生产乙醇和啤酒 生产淀粉酶
2013-8-20
42
思考题：
1、说出固定化酶的含义，并分析固定化酶的优点有哪些？
2、固定化酶的方法有哪几种？比较其优缺点。 3、解释固定化酶活力大都下降的原因。 3、举例说明如何选择固定化酶。 4、固定化酶或细胞的常见形式有那几种？它们与制法及 用途有什么联系？ 5、解释固定化细胞比固定化酶发展快的原因。
2013-8-20
43
26
四、固定化酶的形状和性质
1. 固定化酶的形状 颗粒、线条、薄膜和酶管等。颗粒占主要， 主要用于工业生产，薄膜主要用于酶电极。 2. 固定化酶的性质 酶活力（下降），稳定性（提高），酶学 特征（与游离酶有所不同）
2013-8-20
27
五、固定化酶的应用
1、使用酶柱式固定化酶连续催化反应 乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
（2）制备固定化细胞的方法
已经使用的固定化方法种类繁多，千变万化，
新的方法也不断涌现。一般认为，理想的固定
化细胞的制备方法，应该具有如下特点：
1）应该能够控制固定化细胞的大小和孔隙度；
2）固定化所使用的原料应该便宜、易得，固定
化成本尽量低；
2013-8-20
35
3) 固定化方法简单、易行，固定化过程应尽可能
固定化氨基酰化酶
2013-8-20
14
包埋法
将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜 的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。
优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅
仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几
乎不起变化，可适用与多种不溶酶的制备。
2013-8-20
16
缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发
温和，尽量少损伤细胞；
4) 固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用
的pH值和温度下，不会被破坏；
5) 固定化细胞应具有良好的机械稳定性和化学稳
定性；
2013-8-20
36
6) 载体对细胞应该是惰性的，即不损伤细胞；
7) 固定化细胞应该使底物、产物和其他代谢产
物能自由扩散； 8) 单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的 细胞。
生催化作用。所以用包埋法制备的酶，一般只
适用与小分子底物。
包埋法又分为：微胶囊包埋法
胶格包埋法
2013-8-20
17
微胶囊包埋法
将酶包埋在半透性聚合体膜内，形成的直径为1~100um。 例如，天门冬酰胺酶（asparaginase)就是用这种方法作成微胶囊。
2013-8-20
18
胶格包埋法
首先被采用的胶格包埋法是：
1、吸附法
2、包埋法
3、通过双功能试剂进行共价交联 4、和水不溶性载体共价结合
2013-8-20 8
吸附法 酶被吸附于惰性的固相载体或离子交换剂。根据
酶分子与载体吸附的性质有物理吸附和离子吸附 之别。
物理吸附法 使用对酶蛋白有高度吸附能力的硅胶、活性炭， 氧化铝、高岭土、石英沙、火棉胶、多孔玻璃等在 一定条件下与水溶酶作用制得。 这些具有吸附能力的物质就叫做载体。
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
2013-8-20
21
图 7－11
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载
体常有一定的机械强度；
4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性，即 要保护活性中心基团； 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 量，具有最小的空间位阻；
6.固定化酶应有最大的稳定性；
7.固定化酶应易与产物分离。
2013-8-20 7
三、固定化技术
2013-8-20 33
系统，并防止外来细胞对它的侵袭，就能使此细胞
反复使用。
③细胞膜具有选择性，它往往阻止人们因生产某种
产品所加特定底物的进入，这是细胞固定化要考虑
的问题。
④微生物细胞具有维持其生命活动的完整的酶系统，
在制备固定化菌体细胞的过程中应尽可能完整地保
持细胞的这种特定状态。
2013-8-20 34
• 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰 胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
2013-8-20
19
交联法
依靠双功能基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联，凝集 成网状结构而成为固定化酶，最常用的双功能试剂有戊二醛、 顺丁稀二酸酐和乙烯共聚物等。那么酶蛋白中的游离氨基、 酚基、咪唑基及巯基均可参与交连反应。 双功能试剂：
2013-8-20
10
优点：操作简单，反应条件温和，酶活力损失
少，载体可反复使用。
缺点：易引起蛋白质表面变性，且由于结合力
弱，当反应液的pH值、离子强度、温度、底
物浓度等发生变化时，会导致酶易从载体上 部分或全部脱落。
2013-8-20
11
离子结合法
利用含有离子交换基团的固相载体（如具有 交换基团的葡聚糖凝胶或纤维素）与酶蛋白分子 的带电基团互相吸引（靠离子链）而形成络合物。
优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活 性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较 高的固定化酶。 缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下
进行反应时，酶与载体易分开。
2013-8-20
13
第一个离子结合法固定化酶：
DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50
生素发酵），只要提供所要产物必需的前提物质， 固定化细胞可以进行长时期的操作；
2013-8-20
39
（4）固定化细胞的生理学特性 固定化细胞的一个最明显和最重要的生理学特 性，是细胞的生理状态，即是否具有生理活力。 如图所示：
第一类固定化wk.baidu.com胞一般只适用于一种酶催化的
反应。第三类固定化细胞适用与多酶反应，特
主要内容
一、什么是固定化酶 二、制备固定化酶的依据 三、固定化技术 四、固定化酶的形状和性质 五、固定化酶的应用 六、固定化细胞
2013-8-20
3
一、什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
2013-8-20 4
固定化酶：是被固定在某一有限空间内不再能自 由流动而仍有催化活性的酶。
生化代谢产物，需由多种酶经多步酶促反应才能
合成。多酶反应器，为制造那些在有机合成上很
棘手的，结构复杂的生化代谢物开辟了一条新的
途径。
3、 固定化酶在分离提纯上的应用
生物体内的生物高分子和小分子配基之间（如酶
蛋白分子与辅酶之间，酶蛋白分子与抑制剂分子
之间，抗体分子和抗原分子之间等）都有一定的 亲和力，从而能形成络合物，这些络合物也能在 一定的条件分离。利用这种性质，把构成络合双 方的任何一方加以固定化，并装成层析柱，就能
优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活。
2013-8-20 5
二、制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催
化能力和常温、常压下能起催化反应等特点； 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用；
2013-8-20 22
共价结合法
酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆
的连接。一般在温和条件下能参与偶联的蛋白质基团包 括：游离羧基（包括肽链C-末端的α-羧基等）、游离氨
基（如肽链N-末端的α-氨基）等。
2013-8-20
23
共价结合法要注意两个问题： ①参加载体共价结合应不是活性中心基团，也不是参与 酶蛋白的高级结构的必需基团，否则会使固定化酶不呈 现出酶活力。 ②载体必须具有在温和条件下可与酶蛋白发生偶联反应 的基团，又有一定的机械强度和较大的表面积。
2013-8-20
37
（3）固定化细胞的性质 与固定化酶和游离的细胞比较 a.既不要把酶从微生物抽提出来，也不要对其进行 提纯处理；
b.使用固定化细胞可以消除酶所固有的不稳定性
带来的困难；
c.使用固定化细胞，可获得较高的酶稳定性；
2013-8-20 38
d.使用固定化细胞，有利于反应的连续化；
e.当产物的生物合成并非与菌体生长有关时（如抗
第六章 酶与微生物细胞的固定化
2013-8-20
1


教学时数：4学时
教学目的与要求：要求学生了解什么是固 定化酶，掌握固定化酶制备的依据及制备 方法，能说出固定化酶的应用，并掌握固 定化细胞的方法； 教学重点：固定化酶及细胞制备的依据及 方法； 教学难点：固定化酶及细胞的制备及应用 。
2


2013-8-20
从溶液中专一地分离提纯构成络合物的另一成分。
又固定化酶发展起来的分离技术统称为亲和层析
技术。
六、固定化细胞
直接把微生物细胞固定化。 （1）固定化细胞的依据 ①广义上讲微生物细胞所具有的酶系相当于被一层层 具有选择透过性的细胞膜和质膜所包埋，这些酶本身
就是固定化酶。
②设法除去细胞特有的对细胞本身起自溶作用的酶