哺乳动物体细胞克隆

供体细胞
早期胚胎卵裂球 ；胚胎干细胞 ；分化的 体细胞 G1/G0（NEBD、PCC ）单倍染色单体 S （NEBD、PCC ） DNA损伤 G2 、M （NEBD、PCC ）双倍染色单体

维持重构胚正确倍性
移入确定细胞周期阶段的细胞核：
G1/G0， G2 ，M 先 激 活 卵 母 细 胞 受 体 ： 万 能 受 体
示成熟卵 母细胞 卵巢
发育的胚胎
移植 代孕母 克隆动物
胞质供体动物
卵母细胞体外成熟
A：刚抽出的卵母细胞； B：IVM（体外成熟）19小时的卵母细胞； C：成熟的卵母细胞
体细胞移植过程
A-E：盲去法； F-J：挤压法
体细胞核移植重构胚体外发育各阶段
A：核移植； B：融合卵； C：2细胞； D：4细胞； E：8细胞； F：8-16细胞； G：16细胞； H：32细胞； I：囊胚； J：孵化囊胚
哺乳动物体细胞克隆
一、克隆的发展概述
1938年，德国胚胎学家Spemann建议
把一个受精卵的细胞核去掉，然后将 发育到较高阶段的细胞核放进去，观 察核能否发育，这就是核移植 （nuclear transfer, NT）的开始。但因 当时技术条件所限，未能付诸实践， 这已经成为当今克隆技术的蓝图。
用MII卵母细胞作为受体几种不 同的核质组合
移核的同时伴随MPF活性的下降 延迟活化
：移植过一段时间之后， 在激活卵母细胞 ；融合液中不含钙、 镁离子 先活化卵母细胞：（万能受体）但 不利于核重新编程
五、克隆动物发育异常





核移植过程中基因组的后生（Epigenetic）重新程 序化 胚胎干细胞（ES）细胞和体细胞的发育能力 X-染色体失活 端 粒 供体细胞和受体卵母细胞线粒体的命运 克隆动物的表型
八、供体细胞和受体卵母细 胞线粒体的命运
同种克隆 异种克隆 结论

同种克隆
动物种类 线粒体DNA 来源
10头克隆羊（血、 受体 骨骼肌、胎盘、奶）
十头克隆牛 七头--- 供体：受体比例不变 三头--- 供体来源的线粒体在显著减少 甚至没有 线粒体DNA的异质性可能是哺乳动物 死亡率以及异常的一个原因?
2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞
受精卵 2-细胞
电融合形成 4倍体胚胎
2N的ES细胞
4N胚胎细胞 来源的胎盘
体外培养的 ES细胞系
2N的ES细胞
内细胞团
卵母细胞
培养的体细胞
三、动物克隆的应用
治疗性克隆 与转基因技术结合生产转基因克隆
动物 拯救濒危动物
治疗性克隆
去核卵母细胞 休细胞活检 体细胞核移植 胚胎分裂
端

粒
克隆个体的细胞端粒长度与体细胞端粒长度 是否一致?克隆个体一出生其细胞的寿命就与 体细胞相同，会出现早衰现象? 包括“多莉”在内的克隆绵羊细胞的端粒长 度比正常的要短 端粒长度的恢复与胚胎发育过程中端粒酶的 活性升高有关 端粒酶活性的重新表达用作判断重构胚核重 编程程度和时间的一个标志
45 33 18 20 59 1385 323 269 72
30.6 11.9 38.3 21.3 34.3 56.1 18.3 67.8 39.3
5 28 6 4 32 1385 314 269 72
核移植过程中基因组的后生 （Epigenetic）重新程序化和
配子的发生过程不同
克隆胚胎的重新程序化和配子 的发生过程不同
羊
绵羊
8-16细胞胚胎
胎儿胚盘(embryonic disc, ED)体外培养获得细胞系
1997
猴
早期胚胎的卵裂球
第二阶段是用体细胞核进行的核移植
日期 动物种类 国家
1997 1998 1998 2000 2002 2002 2003 2003 2003 2005 2007
绵羊 牛 小鼠 猪 猫 兔 马 骡 大鼠 狗 狼
X-
染 色 体 失 活
克隆动物的X-染色体失活
组织 X染色体失活 正常雌 性胚胎 胚 胎 的 胚 胎 随机 系（外胚层） 胚胎外的滋 养层（TE） 父本 核 移 植 雌供核 随机 随机
X染色体 失活有关 基因 G6PD PGK Xist 胚胎发育阶段
桑椹胚
显著提高 相似 显著提高
囊胚
显著降低 显著提高
按照供体细胞的类型不同将核 移植的发展过程分为三个阶段
第一阶段是用早期胚胎细胞的卵
裂球作为的核移植 第二阶段是用体细胞核进行的核 移植 第三阶段是异种克隆
第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植
日期
1981 1983
动物种类
小鼠 小鼠
技术特点
胚胎细胞 NT+电融和
1986
1994
克 隆 技 术 与 基 因 修 饰
活体采卵 新鲜卵巢
基因打靶动物
基因打靶克隆羊
正常出生三周龄转基因克隆牛
四、受体胞质与供体细胞核的 细胞周期相互关系
受体
供体细胞
维持重构胚正确倍性
受体
去除原核的合子 供体：原核或假原核 早期胚胎 供体：具有全能性的卵裂球 MII卵母细胞 供体：各阶段胚胎的卵 裂球、早期胎儿细胞、体细胞、ES细胞
呼吸系统 循环系统 免疫系统、肾、大脑障碍 后期死亡 胎儿过重综合症(有：牛、绵羊、小鼠； 无：山羊、猪)与着床及着床后发育期重 要作用的基因（IL6、 FGF4、FGFr2）在 一部分核移植的桑椹胚和囊胚中异常表 达

80
120
14.2
42.1
80
112 13
14
3 1 4 4 5 3 3 31 5 34 5
17.5
2.7 7.6 80.0 14.3 83.3 75.0 9.4 2.2 1.6 12.6 6.9
McCreath 2000
Baguisi 1999 Chan 2000 Shiga 1999 Gibelli 1998 Kato 1998 Kato 1998 Hill 2001 Wakayama 1998 Wakayama 1999 Onishi 2000 Polojaeva 2000
英国 日本 美国 美国 美国 法国 意大利 美国 法国 韩国 韩国
第三阶段是异种克隆
日期
1998 2000 2001 2001
动物种类
“贵妇”珍稀母牛 野黄牛（Bos gaurus） “Noah”牛 欧洲盘羊
成功的哺乳动物克隆要事统计表
克隆动物 小鼠 绵羊 牛 小鼠 免 猪 牛 猴子 小鼠 绵羊 绵羊 牛 小鼠 牛 珍稀牛 山羊 小鼠 小鼠 牛 猪 猪 猪 盘羊 猫 免 供体细胞种类 合子核 4-16细胞期胚胎 4-细胞期胚胎 8 -细胞期胚胎 8-细胞期胚胎 4-细胞期胚胎 内细胞团 4-32细胞期胚胎 内细胞团和滋养层细胞 培养的胚盘细胞 乳腺细胞 培养的卵丘及输卵管上皮细胞 新鲜分离的卵丘细胞 转基因胎儿成纤维细胞 培养的成年珍稀牛颗粒细胞 转基因胎儿成纤维细胞 成年雄性小鼠尾尖细胞 胚胎干细胞 17岁牛耳成纤维细胞 胎儿成纤维细胞 培养的成年猪卵丘细胞 胎儿成纤维细胞 盘羊颖粒细胞 培养的成年猫卵丘细胞 卵丘细胞 受体细胞种类 受精卵 卵母细胞 卵母细胞 2-细胞胚胎 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞和爱精卵 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 卵母细胞 作者 Mcgrath和solter Willadsen Prather等 Tsunoda Stice和robl Prather等 Sims和first Meng等 Tsunoda和kato Campbell等 Wilmut等 Kato等 Wakayama等 Wells等 Cibelli等 Baguisi等 Makayama和Yanegicechi Wakayama等 Kubota等 Onishi等 Pojejaeve等 Betthauser等 Loi等 Shin等 Chesne等 发表时间 1983 1986 1987 1987 1988 1989 1993 1997 1998 1996 1997 1998 1998 1998 1998 1999 1999 1999 2000 2000 2000 2000 2001 2002 2002
绵羊胚盘细胞系 绵羊胚盘细胞系 绵羊胎儿成纤维细胞 绵羊乳腺细胞 绵羊胎儿成纤维细胞
绵羊胎儿成纤维细胞
山羊胎儿成纤维细胞 恒河猴胚胎切割 牛肌细胞 牛胎儿成纤维细胞 牛卵丘细胞 输卵管上皮细胞 胎儿成纤维细胞 小鼠卵丘细胞 小鼠胚胎干细胞 猪胎儿成纤维细胞 猪粒细胞
393
285 368 147 276 47 94 172 2468 1765 397 183
病人 移植
囊胚
肌肉细胞 造血干细胞
神经细胞 内细胞团培养 内细胞团 诱导分化 （胚胎干细胞） 免疫手术法
核供体动物 动物胚胎 胎儿 胎儿成纤 维细胞 细胞系 卵 母 细 胞 体外培 养 供核细胞 克隆技术 重构胚 胚胎移植 技术 代孕母 代孕母 克隆动物 应用 农业、医学、生物学、动物模型、器官移植 转基因动物 动物受精卵 成年动物 分子生物学 ES←PGCs 基因打靶 打靶载体 分子生物学 动物囊胚 注射 超排 胞 质 供 体 动 物 卵裂球 细胞系 各种体细胞 细胞系 显微注射 基因转染←外 源基因
连续核移植
A：培养贴壁的体细胞、B：消化下来供体核移植的体细胞、 C体细胞核移植、D：重构囊胚经链霉蛋白酶消化掉透明带、 E：经无钙离子、镁离子的培养液处理后分离成单个卵裂球、 F：连续核移植、G：融合卵、H：重构囊胚
பைடு நூலகம் 连续核移植方法
卵母细胞 卵母细胞 培养的体细胞 受精卵
三种连续核移植方法示意图 （黑色箭头：体细胞核移植；红色箭头：以重构胚裂球作为供核；蓝色箭头：原核互换；紫色箭头：2-细胞互换）
二、克隆的研究方法
常规方法
连续核移植方法
2N-4N嵌合体产生完全来源于供
核细胞
常规哺乳动物克隆程序
注入支核 卵母 细胞间周隙 供核细胞 取出核 注入去核 卵母细胞 与去核卵母 细胞共培养 核供体动物 去核卵母细胞 卵母细胞 MII期 体外成熟
电融合
重构克隆胚胎 激活 体内培养 体外培养 超排
供体基因没有重新编程
克隆
胚胎死亡 供体基因部分重新编程 异常 供体基因成功重新编程 正常的动物
发育 产生
胚胎干细胞（ES）细胞和体细 胞的发育能力
供体细胞 囊胚 发育阶段 新生儿 成体
ES细胞
卵丘细胞 成纤维细胞
10-20%
70% 58%
5-21%
2-3% 0.5-1%
1-15%
1-2% 0.5%
备注
异种克隆
供体 受体 线粒体 受体 受体 Bos gaurus 欧洲盘羊 Bos taurus
Bos indicus 桑椹胚卵裂 球
Bos taurus卵母细 胞
8细胞前：供体无变化 8细胞后：供体很少（0-0.005%）或没有 55天胎儿各种组织：2.7%受体 克隆个体：无受体 着床前胚胎：供受体共存 着床后：供体
ES细胞的囊胚发育率低而卵丘细胞
的囊胚发育率高，因为ES细胞60% 处于S期，卵丘细胞90%以上处于G0 或 G1期 ES细胞的重构胚移植后能发育到期 的比例是体细胞的10-20倍，未分化 的ES细胞需要的重编程少，基因组 的后生状态与早期胚胎更相似，更 有利于作核供体
From Seminars in Cell & Developmental Biology, 2003
不同文献获得的克隆效率
供核细胞 重构胚 数 量 / 个 244 255 148 247 507 形成囊胚 数量/个 34 126 47 29 69 表成率/% 13.9 49.4 31.8 10.9 13.6 移植胚 数 量 / 个 34 87 40 29 67 出生 数量/个 5 4 3 1 7 出生率 /% 14.7 4.6 7.5 3.4 10.4 Campbell 1966 Wolmut 1997 Wilmut 1997 Wilmut 1997 Schnieke 1997 文献
大熊猫体细 胞
兔卵母细胞
通过核移植的方法来纠正与母性线粒体 DNA遗传异常有关 用此方法产生异质性线粒体DNA疾病的 动物模型

结论：核移植过程中供体来源的 线粒体命运如何还没有一个完全一致 的规律，但总的来说供体来源的线粒 体是呈减少的趋势
克隆动物的表型

发育异常 印记基因异常
发育异常