第四章 目的基因的转化及其原理

中间克隆载体
中间表达载体 onc-
中间黏粒载体 质粒/黏粒载体 基因标记载体
onc+
一元转化载体 （顺式载体）
双元转化载体 （反式式载体）
共整合载体
SEV（拼接末端载体； split-end vector）
6
二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
• 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 • 2、T-DNA的基因结构与功能 • 3、Vir区操纵子的基因结构与功能
TATAbox、AATAAbox及polyA等。
16
• T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序 列（border sequence），分别称之为左边界（BL或TL） 和右边界（BR或TR）。
• 该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更 为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心 部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。
8
章鱼碱基因 毒力区
图3-1 章鱼碱型Ti质粒基因图。
T-DNA区 细胞分裂素基因
结合转移区 生长素基因
冠瘿碱代谢
复制起始区
冠瘿碱合成
9
2. Ti质粒的功能区域
• Ti质粒可分为四个区：
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转
质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转 移，因此称之为接合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
11
3. Ti质粒的生物学功能
•Ti质粒的功能可归为以下7个方面:
①参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。 ②诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。 ③赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。 ④赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。 ⑤为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。 ⑥决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌 体的“排外性”。
1
第四章 目的基因的转化及其原理
第一节 植物基因工程载体及其构建
2
植物基因转化系统
• 载体转化系统（Ti质粒转化载体，Ri质粒转化载 体）
• 原生质体DNA直接导入转化系统 • 基因枪DNA导入转化系统 • 花粉粒介导转化系统
3
一、植物基因工程载体命名规则及种类
• 1、植物基因工程载体命名规则：
• (1)
pSC101
Stanley Cohen(人名) plasmid
pTiT37/pAtT37
根癌农杆菌的质粒类型 （Agrobacterium tumefaciens）
pRiT37/pArT37
发根农杆菌的质粒类型 （Agrobacterium rhizogenes）
4
（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示， • 如：leu （亮氨酸基因位点）
13
二、T-DNA的基因结构与功能
• 1.T-DNA的发现
Chilton 等 人 于 1982 发 现 。 (MD CHILTON, D TEPFER, A PETIT, D CHANTAL , CD FRANCINE, T JACQUES. Agrobacterium rhizogenes inserts TDNA into the genomes of the host plant root cells. Nature,1982(295):432 - 434 ）
分解精氨酸 分解农杆菌 分解胭脂碱 合成胭脂碱 分解章鱼碱 合成章鱼碱 复制起点 抑制长根 抑制长芽 Ti质粒转移 质粒不相容性
4-5 — 18-20 0-1 — — 33-35 206-207 202-203 121-123 33-35
9-10 54-57 — — 39-41 0-1 90-95 190-192 187-188 21-30 90-95
移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上 的基因与肿瘤的形成有关。
（2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒
性，故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相 邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。
10
（3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti
研究证明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后， 转移到肿瘤细胞，故称之为转移DNA（transferredDNA）。
14
图3-2 Ti质粒上几个重要区域及其序列 LB：左边界序列； RB：右边界序列
15
2. T-DNA的结构特点
• l Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb； • l T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中； • l 在T-DNA的5´端和3´端都有真核表达信号。如
基因表现型用正体表示，如Leu （3）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后
加该位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分别 为突变型或缺陷型，表示为：leuA、leuB (4)抗性和敏感性分别用R或r，S或s表示
5
2、植物基因工程载体的种类及特性
植物基因 工程载体
克隆载体 中间载体 卸甲载体
转化载体
12
基因缩写
age
表4-1 Ti质粒放入部分基因及其功能
表型及功能
在基因图上的位置（kb）
Biblioteka Baidu
pTiC58 （211kb）
pTiAch5（195kb）
排斥噬菌体API
111-113
10-12
agr
对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感
138-141
—
arc agc noc nos occ ocs ori roi（tmr） shi（tms） tra inc
7
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
• 1. Ti质粒的遗传特性及类型
• Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合 的环状DNA分子。
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒 可以被分成四种类型：
• 章鱼碱型(octopine) • 胭脂碱型(nopaline) • 农杆碱型（agropine） • 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)