基因工程的基本操作顺序
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c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
PCR原理 5/G—G
3/ C—C 5/ G—G 3/
引物Ⅱ
T—C 3/ 变性
3/ A—G 5/ 引物Ⅰ
复性
G—A 5/ 延伸
5/G—G 3/ 5/G—G
5/ G—G 3/ 引物Ⅱ
超 伤 感 的 座右 铭大全 1、 当 你 觉 得你喜 欢的人 也喜欢 你的时候，一般是你 想 多 了 。 2、 没 有 什么 人能一 路单纯 到底， 但是要 记住，别忘了最初的自己。 3、 致 我 亲 爱 的闺蜜 ：要么 你当我 的伴娘 ，要么 你和我 一起走 向教堂 。 4、 爱 情 就 像 攥 在 手里的 沙子， 攥的越 紧，流 失的越 快。 5、 如 果 你讨厌我，我一点 也 不 介 意 ， 我活着 不是为 了取悦 你。 6、 有 些 话， 总是说 不出，就像有些话，
2、基因表达载体的构建 —— 核心
①用一定的__限__制__酶___切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_黏__性__末__端_____。
②用_同__一__种__限__制__酶__切断目 的基因，使其产生相__同___ 的_黏__性__末__端_____。
③将切下的目的基因片段插入质粒的_切__口___处， 再加入适量_D_N_A_连__接__酶___，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
非编码区 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。
非编码序列：包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的、 不__连__续_的
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具 有调控作用的非__编__码__区组成的
之 间 都 忘 记 了。 17、 以 后 谁 再说爱 你，上 去啪就 一嘴巴 子
补：原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
过化学方法，以单核苷
化学合成
酸为原料合成目的基因。
目的基因
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点
缺点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因
操作过程麻烦，
反转录法 专一性强 mRNA很不稳定，要
求的技术条件较高
根据已知氨基 酸合成DNA法
专一性最强
仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因
T—C 3/
3/ G—A 5/ 引物Ⅰ T—C 3/
3/ G—A 5/ 引物Ⅰ
3/ G—A 5/ 引物Ⅰ
3/ C—C
G—A 5/
5/ G—G 3/
引物Ⅱ
3/ C—C
G—A 5/
5/ G—G 3/
引物Ⅱ
5/ G—G 3/
3/
引物Ⅱ
3/ G—A 5/
引物Ⅰ
（3）人工合成：若基因_较__小__，核苷酸序列又 __已__知__ ，则可用此法。
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA 合成
双链DNA (即目的基因)
基因文库的构建方法
3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的 氨基酸序列，推测出相 应的信使RNA序列，然
蛋白质的氨基酸序列 推测
后按照碱基互补配对原 则，推测出它的结构基
mRNA的核苷酸序列 推测
因的核苷酸序列，再通 结构基因的核苷酸序列
补：真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子 与RNA聚酶 结合位点
编码区
外显子 内含子
非编码区wk.baidu.com
编码区下游
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子，内含子能转录为信使RNA
真核 细胞 的 基因 结构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
练习
1）以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
2、基因表达载体的构建 —— 核心
质粒
DNA分子
同一种限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒） 经此过程，基因表达载体的构建就成功了？
基因表达载体的组成： 目的基因+启动子+终止子+标记基因
3、将目的基因导入受体细胞
转化 ——目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持_稳__定__和_表__达__的过程
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
• 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入 重组DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。
• 所以要对受体细胞作怎样的处理？ 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测
思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核
细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
第二教材P8预习导航
1、目的基因主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___ 请举出三个以上的例子
总 是 守 不 牢 。 7、 我 们 的 故事 ，一点 也不长 ，却足 以我用 一辈子 来释怀 。 8、 早 晚 都 要 放弃的 ，那现 在的坚 持就没 有意义 了。 9、 我 到 现 在才发 现，有 些 东 西 是 我 拼命想 忘也忘 不掉的 。 10、 每 个 人 心 中都有 一道伤 ，那是 曾经天 塌 下 的 地 方 。 11、 孤 单 不 是 因为没 有朋友 ，而是 因为心 里是空 的！ 12、 我 们 就 这 样 ，淡化 一段情 ；你选 择新欢 ，我选 择时间 。 13、 我 们 是 一 枚硬币 的 两 面 ， 永 远都不 会分离 ，可是 ，永远 都不可 能在一 起。 14、 想 一 千 次，不 如 去 做 一 次 。华丽 的跌倒 ，胜过 无谓的 徘徊。 15、 不 爱 你 我有 无数理 由，爱 你 只 有 一 个 理由， 我就是 爱你。 16、 曾 经 我 以为 念念不 忘旳人 ，也就 在一念
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
非编码区
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。 启动子
2、获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
基因文库的构建方法
1）鸟枪法：(直接分离法)
供体细胞中的DNA 限制酶
许多DNA片段 载入
运载体 导入
受体细胞
受体细胞 外源DNA扩增
产生特定性状 分离
目的基因
基因文库的构建方法
2）反转录法：
以目的基因转录成 的信使RNA为模板，反 转录成互补的单链DNA， 然后在酶的作用下合成 双链DNA，从而获得所 需的基因。
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计
施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行
碱基互补配对的步骤是
（C ）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
(2)利用PCR技术扩增
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_复__制____
③条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、__一__对__引__物___ (做启动子)、
• 怎样进行检测？ 通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测
4、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交
③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
PCR原理 5/G—G
3/ C—C 5/ G—G 3/
引物Ⅱ
T—C 3/ 变性
3/ A—G 5/ 引物Ⅰ
复性
G—A 5/ 延伸
5/G—G 3/ 5/G—G
5/ G—G 3/ 引物Ⅱ
超 伤 感 的 座右 铭大全 1、 当 你 觉 得你喜 欢的人 也喜欢 你的时候，一般是你 想 多 了 。 2、 没 有 什么 人能一 路单纯 到底， 但是要 记住，别忘了最初的自己。 3、 致 我 亲 爱 的闺蜜 ：要么 你当我 的伴娘 ，要么 你和我 一起走 向教堂 。 4、 爱 情 就 像 攥 在 手里的 沙子， 攥的越 紧，流 失的越 快。 5、 如 果 你讨厌我，我一点 也 不 介 意 ， 我活着 不是为 了取悦 你。 6、 有 些 话， 总是说 不出，就像有些话，
2、基因表达载体的构建 —— 核心
①用一定的__限__制__酶___切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_黏__性__末__端_____。
②用_同__一__种__限__制__酶__切断目 的基因，使其产生相__同___ 的_黏__性__末__端_____。
③将切下的目的基因片段插入质粒的_切__口___处， 再加入适量_D_N_A_连__接__酶___，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
非编码区 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。
非编码序列：包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的、 不__连__续_的
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具 有调控作用的非__编__码__区组成的
之 间 都 忘 记 了。 17、 以 后 谁 再说爱 你，上 去啪就 一嘴巴 子
补：原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
过化学方法，以单核苷
化学合成
酸为原料合成目的基因。
目的基因
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点
缺点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因
操作过程麻烦，
反转录法 专一性强 mRNA很不稳定，要
求的技术条件较高
根据已知氨基 酸合成DNA法
专一性最强
仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因
T—C 3/
3/ G—A 5/ 引物Ⅰ T—C 3/
3/ G—A 5/ 引物Ⅰ
3/ G—A 5/ 引物Ⅰ
3/ C—C
G—A 5/
5/ G—G 3/
引物Ⅱ
3/ C—C
G—A 5/
5/ G—G 3/
引物Ⅱ
5/ G—G 3/
3/
引物Ⅱ
3/ G—A 5/
引物Ⅰ
（3）人工合成：若基因_较__小__，核苷酸序列又 __已__知__ ，则可用此法。
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA 合成
双链DNA (即目的基因)
基因文库的构建方法
3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的 氨基酸序列，推测出相 应的信使RNA序列，然
蛋白质的氨基酸序列 推测
后按照碱基互补配对原 则，推测出它的结构基
mRNA的核苷酸序列 推测
因的核苷酸序列，再通 结构基因的核苷酸序列
补：真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子 与RNA聚酶 结合位点
编码区
外显子 内含子
非编码区wk.baidu.com
编码区下游
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子，内含子能转录为信使RNA
真核 细胞 的 基因 结构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
练习
1）以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
2、基因表达载体的构建 —— 核心
质粒
DNA分子
同一种限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒） 经此过程，基因表达载体的构建就成功了？
基因表达载体的组成： 目的基因+启动子+终止子+标记基因
3、将目的基因导入受体细胞
转化 ——目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持_稳__定__和_表__达__的过程
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
• 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入 重组DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。
• 所以要对受体细胞作怎样的处理？ 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测
思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核
细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
第二教材P8预习导航
1、目的基因主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___ 请举出三个以上的例子
总 是 守 不 牢 。 7、 我 们 的 故事 ，一点 也不长 ，却足 以我用 一辈子 来释怀 。 8、 早 晚 都 要 放弃的 ，那现 在的坚 持就没 有意义 了。 9、 我 到 现 在才发 现，有 些 东 西 是 我 拼命想 忘也忘 不掉的 。 10、 每 个 人 心 中都有 一道伤 ，那是 曾经天 塌 下 的 地 方 。 11、 孤 单 不 是 因为没 有朋友 ，而是 因为心 里是空 的！ 12、 我 们 就 这 样 ，淡化 一段情 ；你选 择新欢 ，我选 择时间 。 13、 我 们 是 一 枚硬币 的 两 面 ， 永 远都不 会分离 ，可是 ，永远 都不可 能在一 起。 14、 想 一 千 次，不 如 去 做 一 次 。华丽 的跌倒 ，胜过 无谓的 徘徊。 15、 不 爱 你 我有 无数理 由，爱 你 只 有 一 个 理由， 我就是 爱你。 16、 曾 经 我 以为 念念不 忘旳人 ，也就 在一念
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
非编码区
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。 启动子
2、获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
基因文库的构建方法
1）鸟枪法：(直接分离法)
供体细胞中的DNA 限制酶
许多DNA片段 载入
运载体 导入
受体细胞
受体细胞 外源DNA扩增
产生特定性状 分离
目的基因
基因文库的构建方法
2）反转录法：
以目的基因转录成 的信使RNA为模板，反 转录成互补的单链DNA， 然后在酶的作用下合成 双链DNA，从而获得所 需的基因。
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计
施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行
碱基互补配对的步骤是
（C ）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
(2)利用PCR技术扩增
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_复__制____
③条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、__一__对__引__物___ (做启动子)、
• 怎样进行检测？ 通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测
4、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交
③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等