乳酸菌中抑菌物质的分离方法

乳酸菌中有效抑菌物质的分离纯化方法（肽类物质）

1无菌浓缩乳酸菌发酵液的制备

将乳酸菌以1%接种量接种，置于37°C恒温培养箱静置培养36小时至乳酸菌生长达到稳定期后期，将发酵液以8000xg转速离心lOmin，取上清液置于-80℃冰箱中冷冻12h左右，用冷冻干燥机将发酵液冷冻干燥，根据浓缩倍数选择一定体积的浓度为lOmM的乙酸溶液将冻干后的固体重新溶解，将浓缩后的乳酸菌发酵液用无菌滤器过滤，得到无菌发酵液，备用。

2固相萃取

固相萃取柱的活化：将3mL甲醇，3mL去离子水，lmL浓度为100mM的乙酸溶液依次通过固相萃取柱，流速控制在5mL/min。

上样：将浓缩发酵液样品6mL加入固相萃取柱中，流速控制在5mL/min,抽干，收集样品。

水相洗脱：加入3mL去离子水，抽干，收集样品。

乙腈洗脱：加入3mL乙腈，抽干，收集样品。

3固相萃取小柱的选择和抑制真菌肽类物质的初步分离

将乳酸菌的无菌浓缩发酵液，用两种固相萃取小柱CLEAN-UP C18(封尾)和CLEAN-UP C18(未封尾)进行固相萃取实验，将发酵液的成分分为水相洗脱液，乙腈洗脱液和不能被萃取小柱吸附的透过液三部分，将这些样品分别进行高效液相色谱分离，高效液相色谱的条件为：使用戴安UltiMate3000高效液相色谱仪（电雾检测器），XBridge BEH300 C18分析柱(4.6x150mm),流动相A液为水，B液为乙腈（含0.05%三氟乙酸），水相洗脱液，乙腈洗脱液进样体积100u l，洗脱吋间40min，流动相B液所占体积比从0升至90%。

4抑菌能力的生物检测

根据液相图像峰将液相分离出的物质置于真空浓缩仪中蒸干，蒸干后向每个EP管中加入50µl的无菌蒸馏水，溶解后将其转移到96孔板中，向每个孔中加入50µl的MRS培养基，以50µl的MRS培养基加50µl的无菌蒸馏水作为对照，向每个孔中再加入1µl的孢子数为106/mL的米曲霉I#。置于30℃的恒温培箱中培养2-3天，至长出霉菌营养菌体，用酶标仪测定每个样品的OD600。

5乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液中肽类物质的高效液相色谱制备及生物检测将乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液，固相萃取小柱CLEAN-UP C18(未封尾）进行固相萃取实验，将发酵液的成分分为水相洗脱液，乙腈洗脱液和不能被萃取小柱吸附的透过液三部分，将这些样品分别进行高效液相色谱分离，高效液相色谱的条件为：使用shimadzu LC-6AD半制备高效液相色谱仪，XBridge BEH300 Prep C18制备柱（19x150mm)，流动相A液为水，B液为乙腈（含0.05%三氟乙酸），进样体积lmL，洗脱时间40min，流动相B液所占体积比从0升至90%。生物检测方法见（4)，每个样品设置2组平行。

参考文献：

[1]钱洋.乳酸菌对食品中常见霉菌的抑制和黄曲霉素的去除[D].山东大学，2012.

发酵液抑菌物质的分离纯化与鉴定方法

一、抑菌物质的粗分

（1）发酵上清液盐析沉淀样制备

取菌株发酵上清液，用饱和度为80%的硫酸铵，4 ℃盐析沉淀24 h，然后4000 rpm，离心20 min，收集沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解。

将MD44(DM-27)透析袋制成15 cm 的小段，将透析袋放置于2% NaHCO3和1mmol/L pH8.0 EDTA 的沸水浴中煮20 min，然后用蒸馏水或者去离子水浸泡透析袋，然后将其置入1mmol/L pH 8.0 EDTA 中煮10 min，并在 4 ℃条件下贮藏备用。使用前用蒸馏水冲洗透析袋。取10 mL硫酸铵盐析沉淀物水溶液，在装有蒸馏水的容器中进行透析，透析工作温度为 4 ℃。每隔半小时换一次蒸馏水。将2mL BaCl2（10%）溶液放入一试管中，并在试管中滴加2—3 滴透析液，如果有白色沉淀出现，则表明表明SO4-2尚未除净，仍需要透析；如果未出现沉淀，则表明已经完全透析（王本勋，2002）。

（2）发酵上清超滤浓缩液制备

取15mL超滤离心杯，加入发酵上清液，进行二次离心。3000rmp 离心20min，后调转速至3500 rmp，离心20 min。先后用10 KDa、3 KDa 超滤离心杯进行二次离心超滤，取截留液及10倍浓缩滤过液进行抑菌实验。

二、半制备高效液相色谱分离纯化抑菌物质

（1）超滤液半制备型液相色谱条件

由半制备型液相色谱（V ARIAN Prostar 218，美国）测定。色谱柱为Pursuit Rs 5u-C18 柱(150mm*21.2mm)。流动相A 为0.05%三氟乙酸甲醇溶液，流动相B 为0.05%三氟乙酸水溶液。流速为1 mL/min，A/B 在0、30、33 min 时比率分别为10: 90、100: 0、100: 0。检测波长为210nm，进样量 1 mL，发酵液样品处理同 2.2.4.1。

（2）色谱制备液中有机酸检测

利用离子色谱（D20 NEX ICS-3000）测定。色谱柱保护柱为AG11-HC 柱(4mm*50mm)，分析柱为AG11-HC 柱(4mm*250mm)。流动相A 为0.8—34 mM KOH。检测方法：流速为1 mL/min，在0—12 min，KOH 浓度为0.8 mM, 12—40 min，KOH 浓度为0.8 mM—34 mM 梯度洗脱，在40—50min，KOH 浓度为34 mM。柱温：30℃。乳酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸标品购于中国药品生物制品检定所。将五种酸配成混标，备用。

（3）

将第 4 部分进GC-MS，仪器条件如下：色谱仪岛津（SHIMADZU）GCMS-QP2010-plus色谱柱：RTX-5MS(30m*0.25mm*0.25μm)；进样口温度260℃；载气He，1.0mL/min；色谱柱温度：50℃（1min），以5℃/min 速度升温至275℃（3min）；进样量：1.0μL，分流比10:1，恒流模式；接口温度280℃，离子源温度230℃；EI 电子能量：70eV，质量扫描范围：35amu。

参考文献：

[1]李红娟.抗真菌乳酸菌的筛选及特性研究[D].中国农业科学院,2011.