血红蛋白的提取 (2)

（2）凝胶色谱柱的装填
④洗涤平衡：装填完毕后，
立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用 300ml的20mmol/l的磷酸缓 冲液（pH为7.0）充分洗涤平 衡12小时。注意：1、液面不 要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的 流动与最终生物大分子物质的 分离效果。2、不能发生洗脱 液流干，露出凝胶颗粒的现象。
大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖） 构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。
2.凝胶：
3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程
①_相__对__分__子__量__较__小_ 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较___，长移动速度较____;慢 ②_相__对__分__子__量__较__大__的蛋白质无法进入凝胶内部的通道， 只能在凝胶外部移动，路程较___，短移动速度较____。 快
（二）缓冲溶液
1.作用: 3.缓冲溶液的配制:
42如.H在 组2C本成O3课：/N题aH中CO使3，用N的aH缓2PO冲4/液Na是2H:P磷O4等酸缓冲液 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？
（三） 电泳： 1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
阅读来自百度文库66回答
1、电泳方法有哪些？本书采用的是哪种？ 2、SDS的作用？
50cm高
（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓
冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱 柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环 绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
血红蛋白的特点：
每个肽链环绕一个亚铁血红素 基团，此基团可携带一分子氧 或一分子二氧化碳，血红蛋白 因含有血红素而呈红色。
血红蛋白
两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团
用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提 取血红蛋白的原因是什么？
（2）凝胶色谱柱的装填
③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱
柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装 均匀。
注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之
间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡
会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分 离效果。
(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加 40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
一、基础知识
蛋白质分离的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分 子的形状和大小、所带电荷的性质和多 少、溶解度、吸附性质和对其他分子的 亲和力等等，可以用来分离不同种类的 蛋白质。
阅读P64回答：
• 1、凝胶色谱法利用的是蛋白质的哪个性质？ • 2、该方法中哪种物质是关键？如何起到分离
作用？
（一） 凝胶色谱法 1.原理：
(4)透 析：
①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将 透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l 的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。
2.凝胶色谱操作:
（1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨 平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖 尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事 项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面， 否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相 应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨 胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即 每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称 取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分 溶胀后，配成凝胶悬浮液。
类型:
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
电泳检测结果
电泳
1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白 质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子 质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子 质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子 质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋
白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少
B 分子的大小
C 肽链的多少
D 分子形状的差异
二、实验操作
蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（一）血红蛋白 血液有哪些成分？
水分
血浆
血
固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行 DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血 红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
（二）操作过程
1.样品处理及粗分离
(1)红细胞的洗涤:
①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 ②洗涤操作：
1、采集血样。 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白 细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯 化钠溶液洗涤。 5、低速离心（低速短时间） 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色， 表明洗涤干净。