核黄素

核黄素(维生素B2)荧光光度定量测定法
摘要: 维生素B2又名核黄素(Riboflavin),是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物。

由于在异咯嗪的1位和5位N原子上具有两个活泼的双键，易起氧化反应，故维生素B2有氧化型和还原型两种形式，在生物体内氧化还原过程中起传递氢的作用。

在体内核黄素是以黄素单核苷酸（flavin mononucleotide,FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD)形式存在，是生物体内一些还原氧化酶（黄素蛋白）的辅基，与蛋白部分结合很牢。

由于FAD,FAN 广泛参与体内各种氧化还原反应，因此维生素B2能促进糖，脂肪和蛋白质的代谢，对维持皮肤，粘膜和视觉的正常机能均有一定的作用。

本实验采用荧光光度定量测定法测量核黄素的含量.
关键词：核黄素荧光光度还原氧化酶黄素蛋白
Vitamin B2 and Riboflavin (Riboflavin), is the nuclear alcohol and 7, 8 - dimethyl luo oxazine condensation product. Due to the different luo oxazine 1 and 5 N atom has two lively double bond, easy oxidation reaction, so the vitamin B2 type oxidation and reduced in two forms, REDOX process in biological hydrogen transfer function. Riboflavin in the body is flavin mononucleotide (flavin mononucleotide, FMN) and flavin adenine dinucleotide (flavin adenine dinucleotide, FAD) form, are some reduction in biological oxidase (flavoprotein) prosthetic group, combined with protein part is very fast. Because the FAD, FAN widely participate in various REDOX reaction in the body, so vitamin B2 can promote sugar, fat and protein metabolism, to maintain the skin, mucous membrane and have certain effect to the normal function of vision. This experiment adopts the quantitative determination of fluorescent photometric method of measuring the content of riboflavin.
前言
1.1 核黄素的概述
维生素B2（化学式：C17H20N4O6，式量376.37）又叫核黄素，微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。

为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。

其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等，故本品可用于上述疾病的防治。

体内维生素B2的储存是很有限的，因此每天都要由饮食提供。

维生素B2的两个性质是造成其损失的主要原因：
（1）可被光破坏；
（2）在碱溶液中加热可被破坏。

1.2 核黄素的生理功能
主要是与维生素B2分子中异咯嗪上1,5位N存在的活泼共轭双键有关，既可作氢供体，又可作氢递体。

在人体内以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）两种形式参与氧化还原反应，起到递氢的作用，是机体中一些重要的氧化还原酶的辅基，如：琥珀酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶及NADH脱氢酶等。

主要参与的生化反应有呼吸链能量产生，氨基酸、脂类氧化，嘌呤碱转化为尿酸，芳香族化合物的羟化，蛋白质与某些激素的合成，铁的转运、储存及动员，参与叶酸、吡多醛、尼克酸的代谢等。

1、参与体内生物氧化与能量代谢，与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢有关，可提高肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育，维护皮肤和细胞膜的完整性。

具有保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能。

2、参与细胞的生长代谢，是肌体组织代谢和修复的必须营养素，如强化肝功能、调节肾上腺素的分泌。

3、参与维生素B6和烟酸的代谢，是B族维生素协调作用的一个典范。

FAD和FMN作为辅基参与色氨酸转化为尼克酸，维生素B6转化为磷酸吡哆醛的过程。

4、与机体铁的吸收、储存和动员有关。

5、还具有抗氧化活性，可能与黄素酶-谷胱甘肽还原酶有关。

1.3 核黄素的吸收代谢
膳食中的大部分维生素B2是以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅酶形式和蛋白质结合存在。

进入胃后，在胃酸的作用下，与蛋白质分离，在上消化道转变为游离型维生素B2后，在小肠上部被吸收。

当摄入量较大时，肝肾常有较高的浓度，但身体贮存维生素B2的能力有限，超过肾阈即通过泌尿系统，以游离形式排出体外，因此每日身体组织的需要必需由饮食供给。

1.4 核黄素的作用机理
维生素B2的主要生理功用是作为辅酶促进代谢。

核黄素和磷酸及一分子蛋白质结合成为黄色酶。

这一类酶又叫脱氢酶，重要的是要非常介导的氢原子转移对糖、脂和氨基酸的代谢都很重要。

它是许多动物和微生物生长的必需因素。

维生素B2与特定的蛋白质结合生成黄酶。

黄酶在物质代谢中起传递氢的作用，参与组织的呼吸过程。

2 实验部分
2.1 实验目的
了解荧光法测定核黄素的原理和方法,学习荧光光度计的操作和使用掌握荧光定量分析工作曲线法。

2.2 实验原理
核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，其水及酒精的中性溶液为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸或强碱中易破坏。

核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。

二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：
核黄素的激发光波长范围约为440-500nm（一般定为460nm），发射光波长范围约为510-550nm（一般定为520nm）。

利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比可进行定量分析。

2.3 实验材料
核黄素片（5mg/片）、蛋黄粉、大豆。

930型荧光光度计。

容量瓶100ml（×2）。

试管1.5cm×15cm（×7）。

吸管10.0 ml（×1），5.0 ml（×1），2.0 ml（×1），0.50 ml（×2）。

量筒 1000 ml（×1），100 ml（×1）。

2.4实验试剂
核黄素标准溶液：准确称取核黄素10mg，放入预先装有约50ml蒸馏水的1000ml容量瓶中，加入5ml 6mol/L醋酸，再加入大约800ml水，置水浴中避光加热直至溶解，冷却直至室温，用蒸馏水再定溶至1000ml，混匀。

连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠。

36%醋酸。

2.5操作
标准曲线绘制
将配好的10μg/ml标准核黄素溶液，按表1所示比例稀释成6个标准溶液。

样品溶液的配制
将被测的样品（如核黄素药片，维生素B2针剂等）参照标准溶液的含量范围和溶剂体系配制成测定溶液。

对于食物和生物材料中的核黄素测定，一定需要事先经过抽提，或经过分离，纯化处理。

荧光测定
参照荧光光度计的使用说明，选用滤光片，核黄素荧光测定的激发光波长为460nm，发射光波长为520nm。

因此可选用带通型400nm（蓝色）滤光片为激发光滤光片，选用截止型510nm（红色）滤光片为发射光滤光片。

待仪器预热并调好零点后，用0号标准溶液（2.5μg/ml）作为参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度（100%），分别测定其他标准溶液和样品溶液的相对荧光强度，在测定中如果样品溶液的荧光强度超出100%则需要再行稀释，在每一个测定溶液测定完后，需要重新倒回到相应的试管内。

表1 核黄素的测定——标准曲线绘制
0 1 2 3 4 5
管号
试剂
10μg/ml核黄素标准液/ml 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.2
蒸馏水/ml 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 9.8
总体积/ml 10 10 10 10 10 10
含量/（μg/ml） 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.2
还原前荧光强度F1
加连二亚硫酸钠/mg 10 10 10 10 10 10
还原后荧光强度F2
还原前后荧光强度之差
测定后，在每管测定的溶液中分别加入约10mg的连二亚硫酸钠，经混合溶解后，再重新测定。

数据处理
每一个测定溶液的荧光强度读数校正公式为：
F= F1—F2
式中F：校正后的荧光强度；
F1：：未还原时测得的荧光强度；
F2：还原后测得的荧光强度。

以标准溶液校正后的荧光强度为纵坐标，相应的含量为横坐标，作出核黄素测定的标准曲线。

将样品溶液校正后的荧光强度在工作曲线上查出相应的含量。

2.6注意
在所有操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射
3实验结果与分析
1.标准系列溶液的荧光强度绘制标准曲线
2.据待测液的荧光强度，从标准曲线上求其浓度。

3.计算核黄素片（5mg/片）、蛋黄粉、大豆中的维生素b2的含量用mg/L表示
4结语
核黄素即为维生素B2，是生物生命活动中不可缺少的维生素之一，与人体内碳水化合物，脂肪及氨基酸代谢有着密切关系，对生物发育起着重要作用。

主要应用于临床口角炎，舌炎，肛门炎，结膜炎及脂溢性皮炎等缺乏维生素B2所引起的病症。

近年来，国内外用于抗衰老和保健的多维制剂中都含有B2，这类药物不仅限于治病野用于保健，提高机体的抗病能力和延年益寿，目前国外临床上应用这类药物的各种制剂有200多种，国内有30余种。

参考文献
1.王海;申华;孙亚光;高聪;杨卫东;梁赫;;核黄素制备研究进展[J];化学世
界;2012年05期
2.李文钊;赵学明;;核黄素结晶热力学研究[J];食品科学;2007年04期
3.陈佩林,赵春;微生物发酵产核黄素研究进展[J];畜牧与兽医;2005年04期
4.百度文库/p-105685666.html
5.陈钧辉等，生物化学实验指导书第四版2008.3.260—262
6.《海南大学学报：自然科学版》1997年第4期324-326页共3页
7.李锦全,陈瑞川,蔡克瑕,叶志云;核黄素光化学反应诱导人胃癌细胞凋亡[J];癌症;2003年03期
8.赵常志,陈连山,谭忠印,赵国良;光化学催化-示波电位法测定维生素B_2[J];分析化学;1993年11期
9.黄晓兰,陈云华,张汉英,林定亮;碱性去活性柱液相色谱测定水溶性维生素[J];分析化学;1999年07期
10.谢志鹏;蔡定建;汪敬武;;Na_2SO_3的歧化反应研究及在维生素B_2分析测定中的应用[J];分析试验室;2006年10期
11.刘要武,李叙琳;多种维生素的高效液相色谱分离及应用[J];分析试验。