Vero-细胞-HCP(宿主残留蛋白)ELISA试剂盒说明书分析

Vero 细胞HCP（宿主细胞蛋白）

Vero细胞宿主蛋白酶联免疫检测

目录#F500

预期用途

该试剂盒用于检测用Vero 细胞.生产的制品中是否有宿主蛋白残留。仅供研究和工业生产，不能用于人和动物的诊断。

总结与说明

病毒疫苗或其他治疗用蛋白在Vero细胞中表达使商业用大量生产药物原料产品的经济简便方法。生产和纯化这些产品的过程中会残留Vero细胞中的一些蛋白质（称为宿主细胞蛋白，HCPs）而造成污染。这种污染可以减少药物的疗效，引发毒副反应和免疫学反应，因此最好在实际生产制品过程中将HCPs降低到最低水平。

一些利用抗体来除HCPs的免疫学方法，如Western Blot 和ELISA被广泛使用。虽然Western blot是一种检测HCPs的有效方法，但它受到了一些限制。因为它过程复杂且技术依赖性强，需要操作者对结果进行分析解释。而且，它在本质上是一种定性检测，不能定量分析。Western blot的敏感性易受被检测样品量的影响，也受目的产品浓度的干扰。因此Western blot可用来检测纯化上游的蛋白质，而对纯化下游或终产品的检测灵敏度与特异性较低。本试剂盒中用到的ELISA方法克服了Western Blot的缺点，将敏感度提高了100倍。

ELISA操作简单、客观、可获得半定量的结果，是纯化工艺，过程控制，常规质量检测的最佳选择。这个试剂盒可与纯化过程中残留的可独立污染产品的所有HCPs反应，就这个意义上来说，这个试剂盒是通用的。用Vero细胞轻度裂解物获得抗体并经亲和纯化，得到的最终抗体可以与用于生产各种病毒疫苗和蛋白质产品的四种商用细胞系反应。这一分析表明，绝大多数HCP存在于各种Vero细胞系和纯化过程中。如果你需要一个更为敏感和特异性的方法去检测样品中的HCP量，Cygnus Technologies公司为你推荐一个优于2D Western blot的方法，我们将这个方法称为2D HPLC-ELISA。2D HPLC-ELISA相较于2D Western blot 来说敏感性强，特异性高。要想更多了解此方法，请联系我们公司服务部门。

使用特殊的方法制备抗体，以减少低分子量和低免疫原性污染物以及高分子量组分。例如本试剂盒，可以作为一个工艺过程开发的工具来监控去除宿主细胞污染物的最佳条件，以及确保最终产品发布。

这种敏感性高的酶联免疫吸附试剂盒已被用于检测终产品的HCP，通过对来自不同生长状态和纯化过程的4种疫苗产品的中间产品和最终产品的实际检测来得到结果。我们鼓励该试剂盒的的每个使用者进行类似的验证研究以证明它符合他们的分析需求。这个试剂盒能满足你们的样品需求，不用再运用其他的特异性实验，因为那些实验提供的信息对这个通用的试剂盒来说是重复多余的。但是，如果你的验证研究表明此试剂盒中的抗体与你的样品中的HCP不能充分反应，那就需要同时运用一种特异性的ELISA，且需要特异性强的抗血清。或者，如果该试剂盒中使用的多克隆抗体能提供足够的敏感性和广泛的抗原反应性，可用它替代本试剂盒中经共纯化的污染物制作的标准品，从而在特异的HCP检测过程中达到更好的精确性。使用更多的抗原和抗体所做的特异性分析法的应用理论上具有更好的特异性，但因为它过于特异而不能检测出因为操作不规范或过程改变后产生的一些新的或非典型的污染物。由于这个原因，我们建议用具有广泛反应性的“通用”宿主细胞蛋白检测实验分析最终产品纯度，即使可使用过程特异性分析。如果你认为有必要进行过程特异性分析检测， Cygnus Technologies公司将运用其已经验证的方法开发这种抗体并按顾客要求进行检测。

检测原理

Vero细胞检测是一个双位点酶联免疫检测。样品中包含的Vero Cell HCPs蛋白与标记有抗-Vero Cell抗体的辣根过氧化酶同时反应，反应在之前涂有一层吸附性抗-Vero Cell蛋白抗体的微量滴定板中进行。免疫反构成为夹层结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗微量滴定板，去除未结合反应物。添加TMB作用底物反应。微量滴定板读数器上测定水解物浓度，水解物浓度与Vero Cell HCPs蛋白浓度成正比。

试剂&材料（试剂盒提供）

成分产品#

抗-Vero cell:HRP F501

羊抗Vero cell亲和纯化抗体，用辣根过氧化酶标记。

排列在加有防腐剂的试剂盒中，1x12mL

Anti-Vero cell coated微量滴定板F502*

12×8孔装在含有干燥剂的袋子内

Vero cell HCP标准液F503

含有Vero cell HCP、牛血清白蛋白与防腐剂。

规格有0, 2, 8, 25, 75和200ng/mL . 1 mL/瓶

终止液F006 0.5N硫磺酸1x12mL

TMB F005 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺. 1x12mL

清洗物（20倍浓缩）F004 含防腐剂的Tris缓冲液1x50ml

*除了#F505，所有成分都可单独购买

储存&稳定性

*为了保持稳定，所有的试剂应储存在2°C至8°C，直到打印所示的截止日期为止

*若作为底物的试剂在450nm吸光度大于0.1，则不要使用

*试剂盒所带的复原液在保质期前都是稳定的

材料和器材（试剂盒不提供）

能在450&650nm对微量滴定板进行读数的分光光度计（如果你微量滴定板不能不提供双波长的分析，你可以读取450nm波长）

移液枪50µL 和100µL

多头或多道移液器100µL

微量滴定板旋转器 150 - 200 rpm

样品稀释液推荐用Cat # 1028

蒸馏水

1L洗涤瓶，用来稀释洗液

警告

*仅供研究和工业使用

*终止液是0.5N硫磺酸，禁止眼睛、皮肤或衣服与之接触。试剂盒的其他试剂均无害

*该试剂盒只能由有资格的技术人员操作

试剂预处理

*将所有试剂放到室温下

*用蒸馏水将浓缩的洗液稀释到1L，在试剂盒上贴上标签，写上组别和失效日期，储存在4°C

注意事项

1.正确洗板，除去过量的未反应试剂对保持实验的重复性和灵敏度是必不可少的。我们强烈建议不要使用自动化或其他手动操作的真空吸尘装置清洗板，因为这样会降低特异性的吸光度，增加非特异的吸光度，使精确度改变。下面介绍的人工清洗程序在一般情况下只造成较低的背景干扰，且特异性的吸光度高，精确度更好。

2.样品中HCP浓度高时可观察到高剂量钩状效应或低水平的线性稀释。高剂量钩效应是由于在纯化上游阶段样品的HCP浓度过高，相对来说抗体较低而引起的。浓度大于1mg/mL 的样品，其吸光度低于200 ng/mL的标准液。当抗体浓度超过HCP浓度时，也会出现钩效应。在这种情况下，未稀释的样品的吸光度可能低于试剂盒最高标准液的吸光度。然而，这些样本不能显示随着稀释度增加，HCP 浓度也增加的线性关系。钩状效应最常出现在纯化上游阶段。如果可能出现钩状效应，我们需要对已稀释的样品进行检测。如果未稀释样品中HCP的浓度低于已稀释样品中HCP的浓度，则可能引起钩状效应。这样的样品至少要稀释到用实验中间品和终成品验证了的需要稀释的最低限度（MRDS）。在保证统计学精确度的情况下，一系列能检测出相同HCP值的样品稀释度中，MRD是第一个符合要求的稀释度。据报道，样品的稀释度与HCP值的关联是在已建立的MRD的基础上修正的。所用稀释剂应该准确回收。首选的稀释剂是我们规格为100ml、500ml或1l/