核酸提取

核酸分离、纯化
多酚的去除：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β -巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
盐离子的去除：
70％的乙醇洗涤
核酸沉淀、溶解
基因组DNA的提取
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法
• 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体 上的蛋白变性，核酸释放； • 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别 位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； • 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
异硫氰酸胍/苯酚法
成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中 酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
植物材料
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集
SDS法DNA提取缓冲液
组份 Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ） NaCl SDS
终浓度
10 mM
20 mM
0.4M
2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法

质粒DNA的提取
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉 淀会更充分


沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于 充分沉淀
沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等


晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）
若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
问题三：DNA提取量少。 原 因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分
沉淀不完全
洗涤时DNA丢失
对 策
3.
4. 5.
6.
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒
培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
菌株不要频繁转接（质粒丢失）
细胞裂解
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮 材料应适量，过多会影响裂解， 菌体量适当 导致DNA量少，纯度低
重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
2.
3.
3.
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。 原 因
1.
1.
2.
2.
3.
4.
5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 对 酶的活性 提取过程操作过于剧 策 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
3.
4.
5.
基因组DNA－其它方法
浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离

有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用

密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定 根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组 分分级分离出来。


根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法


根据核酸分离纯化方式的不同有：
吸附材料结合法：
硅质材料 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。
• • •
快捷高效。
阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验。 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物 ，从而达到分离目的。
一、核酸的分离原则及要求
（一）分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。
1、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。
2、核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶 剂和过高浓度的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的 污染应降低到最低程度；
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其
加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15℃。
CTAB提取缓冲液的经典配方

组份 终浓度 Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM 1.4M CTAB 2%(W/V) β-巯基乙醇 0.1%（V/V） 使用前加入
• •
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原 因
1.
DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 DNA中残留有金属离 子
1.
2.
对 策
重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前）
针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
高温温浴时，定时轻柔振荡
变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断 复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染 G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁
③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，
应去除RNA，反之亦然。
（三）核酸分离纯化的注意事项
为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：
① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各 种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过 碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10 条件下进行；
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理
核酸分离、纯化
多糖的去除：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μ L DNA液中加入 200μ l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
核酸分离、纯化
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲 体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的 方法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
步骤:
• 材料准备：尽量新鲜。
• 裂解变性：异硫氰酸胍。使细胞及核蛋白复合物变性，释放
RNA，有效抑制核酸酶。
• 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 • 洗涤：70％乙醇。 • 沉淀：异丙醇、无水乙醇。
乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA
此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。

差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以Байду номын сангаас离。
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低
核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。
二、核酸分离纯化的一般步骤
破碎细胞→提取核蛋白→去除蛋白质、多糖、 脂类等生物大分子→去除盐类、有机溶剂等 杂质→纯化干燥
DNA提取的几种方法


基因组DNA的提取
CTAB法 SDS法
其它
DNA提取的几种方法
核酸提取操作与含量测定
找答案……

核酸分离提取的原则是什么？要达到哪些要求？ DNA和RNA提取总需要注意的要点有哪些？ 核酸如何定量测定，简单说说它们的依据呢？
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
影响RNA提取的因素
材料：
新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以 先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－ 20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存
非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
• 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇沉淀即可使核酸分离出来。
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材 料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在 解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的 材料的DNA时，可增加裂解液中 螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量 轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材 经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避 免反复冻融
DNA提取常见问题
③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核
酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。
• 其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因
此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可 以抑制DNA酶的活性 • 而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐 酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要 危害因素；
④ 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素 主要是机械剪切力，其次是高温。 机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞 突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的
反复冻融等。 主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细
胞的染色体DNA等。

高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力 外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有 破坏作用。
使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度 Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM 1.4M CTAB PVP40 β-巯基乙醇 2%（V/V） 使用前加入
3%(W/V) 5%(W/V)
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形