甾体生物转化羟化反应的机理及条件研究

甾体生物转化羟化反应的机理及条件研究

某某

（成都理工大学化学工程与技术）

摘要：甾体化合物普遍应用于医学等领域，具有不可替代的作用。对于甾体化合物的生物转化又是其合成主要方式。文中讲述了甾体化合物生物转化中的羟化反应及其相应条件影响等。关键词：甾体化合物; 生物转化; 羟化反应。

甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是环戊烷多氢菲类化合物的总称。甾体化合物具有各种生物活性，由于甾体母核上取代基位置种类不同、双键位置或者立体构型等不同，形成了一系列具有独特生理功能的甾体化合物衍生物[1]。

甾体化合物种类繁多，普遍存在于自然界中，成千种甾体化合物已经被报道存在于一些生物体中。比较常见的有：植物组织中的薯芋皂素类、大豆甾醇和油甾醇；昆虫中的蜕皮甾体；动物组织中的糖皮质激素、盐皮质激素类、雌二醇，孕酮和雄酮等性激素、胆固醇、胆酸等；还存在于酵母和霉菌等低等生物中，如麦角固醇等[2]。

甾体化合物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体化合物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等[3]。

而生物转化是利用生物体系将加入到反应系统中的外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值的不同化学产物的工艺[4]。

生物转化涉及的反应类型很多,如加氢、脱氢、氨化、脱氨、酞化、轻化、脱梭、水解、缩合、环氧化、酞胺化;卤化、酷化、脱水、甲基化、磷酸化、糖基转移反应以及底物分子的歧化、异构化、消旋化等[5]。生物转化已经成功地应用于甾体化合物的研究与生产中，特别是甾体的羟化反应。最早应用于工业生产的羟化反应就是利用黑根霉转化黄体酮生成Ⅱα羟基衍生物。本文概述在生物转化甾体化合物中羟化反应的研究进展。

1 羟化反应机理

同位素示踪试验的研究表明，转化到甾体化合物上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢位置，并且取代过程中没有发生立体构型的变化，也不是通过形成烯的中间体来完成的，即羟基取代的立体构型(α或β构型)是由氢原子原来所处的空间位置决定。从图1可以看出，羟化作用的氧不来自于水中的氢氧基(-OH)而是来自于空气中的氧。这一点从理论上说明工业上用黑根霉转化甾体时需要充分供氧的原因。Hoyam曾将C11和C12位上的氢被H3取代的孕甾-3,20-二酮作为底物用黑根霉转化来进行研究，结果说明甾体的酶促羟化反应是羟基化位置上的氢被直接取代[6]。

2底物溶解率的影响

在甾体化合物的生物转化过程中，由于甾体底物溶解性差、培养基传质效率低、底物产物的反馈抑制和全细胞生物催化副产物多等原因，菌株的转化能力和甾体的转化效率仍然偏低，是甾体生物转化技术实现工业化的主要瓶颈。

中国是甾体化合物原料及其制剂的主要生产国，原料药年产值近100亿元，其中70%出口，且皮质激素类原料的生产规模已居世界之首。薯蓣皂素的日渐枯竭造成原料成本价格上升，同时合成的低端产品又缺乏国际竞争力，这给我国甾体药物产业带来了严重的危机。因此，需要积极努力开发新型甾体原料资源，研究收率高、成本低、环境污染小的绿色工艺 [7]。

甾体化合物的原料包括植物甾醇，包括β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，它们主要来自于豆类植物或炼油下脚料。它们具有甾体化合物的母核结构，因而将其“变废为宝”能有效解决水解黄姜所带来的环境污染问题。

其他甾醇原料，如存在于酵母及真菌中的麦角甾醇，又称麦角固醇，是一种重要的医药化工原料，可用于氢化可的松、黄体酮等药物的生产[8]。

因为原料的溶解性问题对甾体化合物的生产占据较大影响，所以寻找新型、有效的甾体药物前体原料仍是未来甾体生物转化方向的主要研究方向。

徐诗伟等[9]在研究地塞米松中间体的1,4脱氢和11α羟基化时，采用N ，N-二甲基甲酰胺溶解底物后进行投料，使产物转化率提高了约40％，且底物转化完全。万金营等[10]在研究黑根霉催化16α，17α-环氧黄体酮的11α-羟基化时，底物经吐温-80处理后最终转化率比对照提高了18％。通过添加溶剂提高底物在转化体系中的溶解度是目前甾体微生物转化过程中最为常见和简单的方法，并且在很多的产业化项目上得以应用。

3甾体羟化酶的研究

早在1981年，Ghosh 等[11]首次研究了Aspergillusochraceus

的无细胞抽提液

图1甾体羟化反应机理（RH 表示底物，ROH 表示相应的产物）

对孕酮的Ⅱα羟化，并对Ⅱα羟化酶进行了初步研究。研究表明该酶是一种诱导酶，主要存在于无细胞抽提液经离心的线粒体后的上清液中，进一步对该上清液离心分离得到微粒体和微粒体后上清液，两者单独存在都不能进行羟化反应，而微粒体部分在添加NaIO4后显示有羟化酶活性，推测羟化酶可能是一种多酶体系，其血红蛋白部分在微粒体中，而微粒体后上清液中可能含有羟化酶系统的非血红蛋白部分。酶的体外羟化活性被氰化物刺激、美替拉酮(metyrapone，细胞色素P450依赖的羟化酶抑制剂)抑制进一步证实微生物羟化反应是由细胞色素P450介导。

4环糊精及其衍生物的影响

如何提高甾体化合物底物在发酵培养基中的溶解度一直是甾体微生物转化的研究热点。一种方法是采用水不溶性的有机溶剂如甲醇、乙醇、DMF和DMSO 等溶解甾体底物，但这类有机溶剂对微生物具有强的毒性作用，因此使用量不能太大；另外也有采用超声粉碎和表面活性剂等方法来提高甾体与菌体细胞的接触，但这些方法都有一定的局限性。

环糊精及其衍生物（如甲基β-环糊精，羟丙基β-环糊精）能形成疏水性空腔，通过氢键、分子间作用力、范德华力等可以与甾体类疏水性强的客体分子相互作用而形成包合物。β环糊精（β-cyclodextrin，CD）是一种外部亲水内部疏水的笼形分子，能与疏水性分子形成包合物，在制药工业中被用来增加药物的水溶性、化学稳定性和生物利用度[12]，更重要的是β环糊精对微生物没有毒性。考虑到这些特点，我们以微生物对雄甾-4-烯-3，17-二酮（androst-4-erie-3，17-dione，AD）Ⅱα羟化反应为例，研究了β环糊精对甾体底物在水中的溶解度及菌种羟化反应的影响，以期通过添加β环糊精增加底物投料浓度，提高羟化反应效率。结果表明β环糊精能显著提高底物AD在发酵培养基中的溶解度，增溶效果优于有机溶剂。

因此，根据甾体化合物的结构特性，合成新型的环糊精衍生物，同时全面分析甾体底物与环糊精的分子识别机制，将有利于进一步挖掘环糊精在微生物转化甾体领域的潜能。单一使用某种有机试剂、表面活性剂或环糊精的效果有限，在实验过程中，可以根据各自的优缺点设计“复合配方”，在不影响菌体生长的前体下，到达高底物投料浓度、高转化率、高产物得率的目的。

5生物转化菌种选育及改良

生物催化剂的种类不够多、适用的反应类型有限是当前限制甾体生物催化发展的因素之一，因此需要大规模从自然界筛选特定功能的催化剂，或对原有的催化剂进行改造。目前在高产菌株的选育中，诱变育种仍然是普遍应用并十分有效的方法，但由于甾体类微生物的转化菌株大多数为放线菌、霉菌等，相对细菌来