百合远缘杂交育种及其真实性鉴定_杨利平
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植物遗传资源学报 2011，12( 6) : 896-903 Journal of Plant Genetic Resources
百合远缘杂交育种及其真实性鉴定
杨利平1 ，李 蕊2 ，程千钉3
( 1 长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100; 2 河北农业大学园林与旅游学院，保定 071001; 3 河北农业大学园艺学院，保定 071001)
3 College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001)
Abstract: Using five wild lily and two lily cultivars as parents． Designing six cross-combination for wide cross breeding． Distant hybrids was obtained successfully by field planting way and ovary culture finally． They were identified by morphology and RAPD molecular identification． The results showed that crossing combination Lilium longiflorum × Lilium callosum obtaining three hybrid seedlings by ovary culture，Lilium callosum × Lilium regale，Lilium callosum בSnow Queen’，Lilium pumilum ( Provenance of Heilongjiang) בSnow Queen’，Lilium pumilum( provenance of Heilongjiang ) × ‘Siberia ’，Lilium pumilum ( provenance of Chengde ) × ‘Siberia ’ obtaining hybrid seeds． The seed set ratio were 27． 0% ，1． 4% ，31． 4% ，0． 04% and 0． 08% respectively． Plant type of hybrid seedlings are matroclinous plants and intermediate plants． The other indexs of morphology lies between parents or better than parents． RAPD molecular identification showed that the hybrids has not only additive banding，solo-parent banding，but also extraordinary banding which is the fusion of its parents，and new bandings appearing in the patterns． The hybrids are true hybrid and can be used to quality breeding of Lily．
殖，即使 获 得 杂 交 种 子 也 可 能 是 由 于 假 杂 交 所 致。鉴于育种中杂种胚和胚乳的不亲和导致的 杂 种 胚 败 育，可 采 用 胚 挽 救 技 术 来 解 决，但 在 培 养过程中，外植体所 携 带 母 体 组 织 也 可 能 诱 导 成 苗。因此，克服杂交 障 碍 获 得 杂 交 种 并 对 其 真 实 性进行鉴定对于百合育种工作具有非常重要的 意义。
基于 PCR 基础上的 RAPD 标记分析技术可在 DNA 水平上鉴定体细胞杂种，其速度快，稳定性好， 准确性高。李富生等［7］用染色体和 RAPD 技术在 幼苗期鉴定了甘蔗杂交种; 马鸿翔等［8］用 GISH 和 RAPD 检 测 黄 毛 草 莓 × 凤 梨 草 莓 种 间 杂 种; Abe 等［9］在研究 亚 洲 百 合 杂 种 系 花 色 素 苷 形 成 的 基 因 分析中，利用 17 个 10bp、37 个 15bp、14 个 20bp 的 随机引物和 33 个 ISSR 引物，绘制出遗传图谱，这些 引物在百合染色体上得到锚定，有确切位点，可以作 为百 合 RAPD 分 析 的 基 础; Persson 等［10］ 和 Wen 等［11］用 RAPD 标记分析了星叶百合和麝香百合居 群内和居群间的遗传变异，研究表明，RAPD 分子标 记在杂种鉴定领域已得到成熟的发展与应用。花 色、香气和抗性品种的获得一直是百合育种的热点， 本试验以不同花色、香气与抗性的百合为亲本，采用 切割花柱授粉进行远缘杂交，结合形态学与 RAPD 分子标记对杂交种真实性进行综合鉴定，旨在获得 花色丰富、花香淡雅，同时具有一定抗性的百合新种 质，为百合资源创新提供基础。
1． 2． 2 培养方法 授粉后 20d 左右切取膨大子房， 首先用 70% 乙醇消毒 1min，0． 1% HgCl2 灭菌 8min， 无菌水冲洗 5 次。将子房切成 0． 3cm 厚度圆形切片， 再沿直径方向切为半圆形，接入子房培养基( MS + 0． 01mg / L NAA) 中培养，蔗糖浓度为 3． 0% ( W / V) ， 用 0． 65% ( W /V) 琼脂粉固化。接种子房在温度 25 ℃ ，光照 16 h / d，光照强 度 2000 lx 条 件 下 培 养。 20 ～ 30 d 后，将 其 含 有 发 育 膨 大 胚 珠 的 切 片 剖 开，剥离出膨 大 胚 珠，在 MS 培 养 基 上 进 行 培 养。 田间获得 种 子 经 消 毒 后 于 MS 培 养 基 上 进 行 培 养。最终在快繁培养基( MS + 0． 5mg /L 6 － BA + 0 ． 1 mg / L NAA ) 进 行 快 繁 培 养，当 幼 苗 长 至 约 5cm 时 转 入 生 根 培 养 基 ( 1 /2MS + 0． 25mg /L NAA) 中培养。 1． 2． 3 计算方法 坐果率( % ) = 坐果数/授粉花 朵数 × 100% ; 有胚种子率( % ) = 有胚种子数 / 胚珠 数 × 100% ; 成苗率( % ) = 成苗数 / 接种数 × 100% 。 1． 2． 4 形态学鉴定 对获得的百合杂种及部分亲 本幼苗在同等温度与光照条件下进行组培快繁，部 分亲本采用种子快繁。将快繁后的大量幼苗转入生 根培养基，25d 后对百合组培苗进行形态学指标观 察与统计并照相，分析杂交种及亲本株高、叶形、根 数、根长、生根率等形态学指标参数，每形态指标观 察统计 200 棵幼苗。分别观察 50 个视野统计叶片 气孔密度。 1． 2． 5 RAPD 分子标记 供试材料总 DNA 提取采 用改良 CTAB 法［11］。用 0． 8% 琼脂糖凝胶电泳检测 样品 DNA 的有无和分子量的大小。用紫外 / 可见分 光光度 计 检 测 DNA 浓 度 和 纯 度: 取 5μl 样 品，加 1995μl 重蒸馏水，分别测定 260nm 和 280nm 处的吸 光度。根据下式计算样品 DNA 的含量: 浓度( μg / μl) = OD260 × 50 × 稀释倍数 /1000。式中: 50 为校正 系数，根据平均碱基组成的 DNA 的摩尔吸光系数而 定。根据公式: 纯度 = OD260 / OD280 计算样品 DNA 的 纯度，如果比值在 1． 5 与 2． 0 之间，样品则被认为是 纯的。
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对于克服百合 杂 交 障 碍 的 研 究，目 前 主 要 集 中 在 柱 头 涂 抹 激 素［2］、KCl 处 理 柱 头 使 其 变 性［3］、柱 头 嫁 接［4］、花 粉 蒙 导［5］ 和 切 割 花 柱 授 粉［6］等，其中以切割花柱授 粉方法简单、易 操 作、 无严格技术要求，并 且 对 克 服 百 合 杂 交 障 碍 具 有 一定效果。
Hale Waihona Puke Baidu1 材料与方法
1． 1 供试材料 以 5 种野生百合与 2 个杂种系百合品种为试验
材料。分别为原生种麝香百合( Lilium longiflorum) ( Ty) 、条叶百合( Lilium callosum) ( T) 、王百合( Lilium regale) ( W) 、细叶百合( Lilium pumilum) ( Xh-黑 龙江种源与 Xc-承德种源) 、雪皇后( Lilium longiflorum，‘Snow Queen’) ( ‘SQ’) 、西伯利亚( ‘S’) 。 1． 2 试验方法 1． 2． 1 杂交方法 设计麝香百合 × 条叶百合、条叶 百合 × 王百合、条叶百合 × 雪皇后、细叶百合( 黑龙 江种源) × 雪皇后、细叶百合( 黑龙江种源) × 西伯 利亚与细叶百合( 承德种源) × 西伯利亚 6 个杂交 组合进行杂交，开花前 3d 对母本进行去雄、套袋，开 花当天 9: 00 － 10: 00 时采用切割柱头授粉，授粉后 继续套袋。授粉后 20d 左右，部分雌蕊用来作为子 房培养，部分留在植株上直到其完全成熟或干枯，作 为田间对照试验。
Key words: Lily; Wide cross breeding; Authenticity; Morphology; RAPD molecular identification
百合类植 物 在 国 际 花 卉 贸 易 份 额 中 的 不 断 提高，促进了其新 品 种 的 选 育 和 推 广。种 内 与 种 间杂交是百合育种 最 重 要 的 途 径，可 人 为 将 有 利 的遗传性状自由组 合，在 田 间 得 到 表 现 后 即 可 获 得新品种［1］。但百合杂交 具 有 明 显 的 不 亲 和 性， 主要表现为受精前 与 受 精 后 障 碍，常 使 杂 种 胚 早 期败育，致使在田间 很 难 得 到 杂 种 种 子 并 加 以 繁
关键词: 百合; 远缘杂交; 真实性; 形态学; RAPD 分子标记
Wide Cross Breeding of Lily and Identification of Authenticity
YANG Li-ping1 ，LI Rui2 ，CHENG Qian-ding3
( 1 College of Life Science and Technology，Yangtze Noramal University，Chongqing 408100; 2 College of Landscape Architecture and Tourism，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001;
摘要: 以 5 种野生百合与 2 个杂种系百合品种为亲本，设计 6 个杂交组合进行远缘杂交，通过子房与田间培养成功获得远 缘杂交种并采用形态学与 RAPD 分子标记对其真实性进行综合鉴定。结果显示，杂交组合麝香百合 × 条叶百合通过子房培养 获得杂交苗 3 株; 条叶百合 × 王百合、条叶百合 × 雪皇后、细叶百合( 黑龙江种源) × 雪皇后、细叶百合( 黑龙江种源) × 西伯利 亚与细叶百合( 承德种源) × 西伯利亚各杂交组合均获杂交种子，结子率分别为 27． 0% 、1． 4% 、31． 5% 、0． 04% 与 0． 08% 。杂 交种株型在苗期表现为偏母植株与中间型植株，其他形态学指标介于亲本之间或优于亲本; RAPD 分子标记鉴定表明，杂种植 株既扩增出相加性带型、单亲本带型，又扩增出融合双亲的特异性带型。获得杂交种为真杂种可用于百合品质育种。
收稿日期: 2010-09-08 修回日期: 2011-05-19 基金项目: 重庆市自然科学基金( CSTC，2011BB1001) ; 长江师范学院科研启动基金 作者简介: 杨利平，教授，研究方向为花卉种质资源及育种。E-mail: ylp1962@ yahoo． com． cn
6期
杨利平等: 百合远缘杂交育种及其真实性鉴定
百合远缘杂交育种及其真实性鉴定
杨利平1 ，李 蕊2 ，程千钉3
( 1 长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100; 2 河北农业大学园林与旅游学院，保定 071001; 3 河北农业大学园艺学院，保定 071001)
3 College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001)
Abstract: Using five wild lily and two lily cultivars as parents． Designing six cross-combination for wide cross breeding． Distant hybrids was obtained successfully by field planting way and ovary culture finally． They were identified by morphology and RAPD molecular identification． The results showed that crossing combination Lilium longiflorum × Lilium callosum obtaining three hybrid seedlings by ovary culture，Lilium callosum × Lilium regale，Lilium callosum בSnow Queen’，Lilium pumilum ( Provenance of Heilongjiang) בSnow Queen’，Lilium pumilum( provenance of Heilongjiang ) × ‘Siberia ’，Lilium pumilum ( provenance of Chengde ) × ‘Siberia ’ obtaining hybrid seeds． The seed set ratio were 27． 0% ，1． 4% ，31． 4% ，0． 04% and 0． 08% respectively． Plant type of hybrid seedlings are matroclinous plants and intermediate plants． The other indexs of morphology lies between parents or better than parents． RAPD molecular identification showed that the hybrids has not only additive banding，solo-parent banding，but also extraordinary banding which is the fusion of its parents，and new bandings appearing in the patterns． The hybrids are true hybrid and can be used to quality breeding of Lily．
殖，即使 获 得 杂 交 种 子 也 可 能 是 由 于 假 杂 交 所 致。鉴于育种中杂种胚和胚乳的不亲和导致的 杂 种 胚 败 育，可 采 用 胚 挽 救 技 术 来 解 决，但 在 培 养过程中，外植体所 携 带 母 体 组 织 也 可 能 诱 导 成 苗。因此，克服杂交 障 碍 获 得 杂 交 种 并 对 其 真 实 性进行鉴定对于百合育种工作具有非常重要的 意义。
基于 PCR 基础上的 RAPD 标记分析技术可在 DNA 水平上鉴定体细胞杂种，其速度快，稳定性好， 准确性高。李富生等［7］用染色体和 RAPD 技术在 幼苗期鉴定了甘蔗杂交种; 马鸿翔等［8］用 GISH 和 RAPD 检 测 黄 毛 草 莓 × 凤 梨 草 莓 种 间 杂 种; Abe 等［9］在研究 亚 洲 百 合 杂 种 系 花 色 素 苷 形 成 的 基 因 分析中，利用 17 个 10bp、37 个 15bp、14 个 20bp 的 随机引物和 33 个 ISSR 引物，绘制出遗传图谱，这些 引物在百合染色体上得到锚定，有确切位点，可以作 为百 合 RAPD 分 析 的 基 础; Persson 等［10］ 和 Wen 等［11］用 RAPD 标记分析了星叶百合和麝香百合居 群内和居群间的遗传变异，研究表明，RAPD 分子标 记在杂种鉴定领域已得到成熟的发展与应用。花 色、香气和抗性品种的获得一直是百合育种的热点， 本试验以不同花色、香气与抗性的百合为亲本，采用 切割花柱授粉进行远缘杂交，结合形态学与 RAPD 分子标记对杂交种真实性进行综合鉴定，旨在获得 花色丰富、花香淡雅，同时具有一定抗性的百合新种 质，为百合资源创新提供基础。
1． 2． 2 培养方法 授粉后 20d 左右切取膨大子房， 首先用 70% 乙醇消毒 1min，0． 1% HgCl2 灭菌 8min， 无菌水冲洗 5 次。将子房切成 0． 3cm 厚度圆形切片， 再沿直径方向切为半圆形，接入子房培养基( MS + 0． 01mg / L NAA) 中培养，蔗糖浓度为 3． 0% ( W / V) ， 用 0． 65% ( W /V) 琼脂粉固化。接种子房在温度 25 ℃ ，光照 16 h / d，光照强 度 2000 lx 条 件 下 培 养。 20 ～ 30 d 后，将 其 含 有 发 育 膨 大 胚 珠 的 切 片 剖 开，剥离出膨 大 胚 珠，在 MS 培 养 基 上 进 行 培 养。 田间获得 种 子 经 消 毒 后 于 MS 培 养 基 上 进 行 培 养。最终在快繁培养基( MS + 0． 5mg /L 6 － BA + 0 ． 1 mg / L NAA ) 进 行 快 繁 培 养，当 幼 苗 长 至 约 5cm 时 转 入 生 根 培 养 基 ( 1 /2MS + 0． 25mg /L NAA) 中培养。 1． 2． 3 计算方法 坐果率( % ) = 坐果数/授粉花 朵数 × 100% ; 有胚种子率( % ) = 有胚种子数 / 胚珠 数 × 100% ; 成苗率( % ) = 成苗数 / 接种数 × 100% 。 1． 2． 4 形态学鉴定 对获得的百合杂种及部分亲 本幼苗在同等温度与光照条件下进行组培快繁，部 分亲本采用种子快繁。将快繁后的大量幼苗转入生 根培养基，25d 后对百合组培苗进行形态学指标观 察与统计并照相，分析杂交种及亲本株高、叶形、根 数、根长、生根率等形态学指标参数，每形态指标观 察统计 200 棵幼苗。分别观察 50 个视野统计叶片 气孔密度。 1． 2． 5 RAPD 分子标记 供试材料总 DNA 提取采 用改良 CTAB 法［11］。用 0． 8% 琼脂糖凝胶电泳检测 样品 DNA 的有无和分子量的大小。用紫外 / 可见分 光光度 计 检 测 DNA 浓 度 和 纯 度: 取 5μl 样 品，加 1995μl 重蒸馏水，分别测定 260nm 和 280nm 处的吸 光度。根据下式计算样品 DNA 的含量: 浓度( μg / μl) = OD260 × 50 × 稀释倍数 /1000。式中: 50 为校正 系数，根据平均碱基组成的 DNA 的摩尔吸光系数而 定。根据公式: 纯度 = OD260 / OD280 计算样品 DNA 的 纯度，如果比值在 1． 5 与 2． 0 之间，样品则被认为是 纯的。
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对于克服百合 杂 交 障 碍 的 研 究，目 前 主 要 集 中 在 柱 头 涂 抹 激 素［2］、KCl 处 理 柱 头 使 其 变 性［3］、柱 头 嫁 接［4］、花 粉 蒙 导［5］ 和 切 割 花 柱 授 粉［6］等，其中以切割花柱授 粉方法简单、易 操 作、 无严格技术要求，并 且 对 克 服 百 合 杂 交 障 碍 具 有 一定效果。
Hale Waihona Puke Baidu1 材料与方法
1． 1 供试材料 以 5 种野生百合与 2 个杂种系百合品种为试验
材料。分别为原生种麝香百合( Lilium longiflorum) ( Ty) 、条叶百合( Lilium callosum) ( T) 、王百合( Lilium regale) ( W) 、细叶百合( Lilium pumilum) ( Xh-黑 龙江种源与 Xc-承德种源) 、雪皇后( Lilium longiflorum，‘Snow Queen’) ( ‘SQ’) 、西伯利亚( ‘S’) 。 1． 2 试验方法 1． 2． 1 杂交方法 设计麝香百合 × 条叶百合、条叶 百合 × 王百合、条叶百合 × 雪皇后、细叶百合( 黑龙 江种源) × 雪皇后、细叶百合( 黑龙江种源) × 西伯 利亚与细叶百合( 承德种源) × 西伯利亚 6 个杂交 组合进行杂交，开花前 3d 对母本进行去雄、套袋，开 花当天 9: 00 － 10: 00 时采用切割柱头授粉，授粉后 继续套袋。授粉后 20d 左右，部分雌蕊用来作为子 房培养，部分留在植株上直到其完全成熟或干枯，作 为田间对照试验。
Key words: Lily; Wide cross breeding; Authenticity; Morphology; RAPD molecular identification
百合类植 物 在 国 际 花 卉 贸 易 份 额 中 的 不 断 提高，促进了其新 品 种 的 选 育 和 推 广。种 内 与 种 间杂交是百合育种 最 重 要 的 途 径，可 人 为 将 有 利 的遗传性状自由组 合，在 田 间 得 到 表 现 后 即 可 获 得新品种［1］。但百合杂交 具 有 明 显 的 不 亲 和 性， 主要表现为受精前 与 受 精 后 障 碍，常 使 杂 种 胚 早 期败育，致使在田间 很 难 得 到 杂 种 种 子 并 加 以 繁
关键词: 百合; 远缘杂交; 真实性; 形态学; RAPD 分子标记
Wide Cross Breeding of Lily and Identification of Authenticity
YANG Li-ping1 ，LI Rui2 ，CHENG Qian-ding3
( 1 College of Life Science and Technology，Yangtze Noramal University，Chongqing 408100; 2 College of Landscape Architecture and Tourism，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001;
摘要: 以 5 种野生百合与 2 个杂种系百合品种为亲本，设计 6 个杂交组合进行远缘杂交，通过子房与田间培养成功获得远 缘杂交种并采用形态学与 RAPD 分子标记对其真实性进行综合鉴定。结果显示，杂交组合麝香百合 × 条叶百合通过子房培养 获得杂交苗 3 株; 条叶百合 × 王百合、条叶百合 × 雪皇后、细叶百合( 黑龙江种源) × 雪皇后、细叶百合( 黑龙江种源) × 西伯利 亚与细叶百合( 承德种源) × 西伯利亚各杂交组合均获杂交种子，结子率分别为 27． 0% 、1． 4% 、31． 5% 、0． 04% 与 0． 08% 。杂 交种株型在苗期表现为偏母植株与中间型植株，其他形态学指标介于亲本之间或优于亲本; RAPD 分子标记鉴定表明，杂种植 株既扩增出相加性带型、单亲本带型，又扩增出融合双亲的特异性带型。获得杂交种为真杂种可用于百合品质育种。
收稿日期: 2010-09-08 修回日期: 2011-05-19 基金项目: 重庆市自然科学基金( CSTC，2011BB1001) ; 长江师范学院科研启动基金 作者简介: 杨利平，教授，研究方向为花卉种质资源及育种。E-mail: ylp1962@ yahoo． com． cn
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杨利平等: 百合远缘杂交育种及其真实性鉴定