实验四 植物叶绿体的提取与观察

实验四植物叶绿体的提取与观察

组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

一、实验目的

了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜观察体外分离的植物叶绿体的一般形态。

二、实验器具及试剂

1．器具

显微镜、天平、擦镜纸、研钵、普通离心机、组织捣碎机、台式低温高速离心机、载片、盖片、带盖离心管、吸管、烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干。

2．材料与试剂

(1)材料

新鲜菠菜叶

(2)试剂

0.35mol/L氯化钠溶液，50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液

三、实验步骤

（一）差速离心

1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(500r/min)匀桨3-5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体 (混有部分细胞核)。

6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。

7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。

（二）蔗糖梯度离心

1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(500r/min)匀桨3-5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4. 在10ml离心管中依次加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液各2ml，再加入菠菜匀浆滤液2ml，8000 r/min离心20分钟，完整的叶绿体停留在50%蔗糖溶液界面上。

5. 将叶绿体吸出，用0.35mol/LNaCl溶液洗涤几次，低速(500r/min)离心，收集沉淀，将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。

6. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。

四、实验报告

1. 绘制所观察到的叶绿体的形态；

2. 比较利用差速离心和蔗糖梯度离心提取叶绿体的效果：纯度高低、活体叶绿体的比例等。