发酵菜粕各种物质的测定方法

1.硫甙含量的测定

1. 原理

硫甙与钯可形成深棕色复合物，此复合物为胶状沉淀物，加入分散剂羧甲基纤维素钠溶液，使复合物变成溶胶清液，进行分光光度测定，可计算硫甙含量。

2. 试剂和溶液

（1）氯化钯（PdCl 2）显色液：称取177 mg 氯化钯于200 mL 烧杯中，加入2 mol/L HCl 2 mL 和蒸馏水20 mL 加热溶解后以蒸馏水稀释至250 mL 。（4mmol/L PdCl 2）

（2）0.1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）溶液：称取1 g 羧甲基纤维素钠放入少量水中，搅拌成浆状，加热至完全溶解后，加水同时搅拌至1000 mL ，必要时加热溶解，放置过夜，倾出上层清夜备用。

3. 测定方法

称取100 mg 装入10 mL 试管中，在沸水浴中干热10 min ，加入约90℃热蒸馏水8 mL -10 mL ，再置沸水浴中20 min 以上，冷却后，蒸馏水稀释，混匀，放置20 min ，用滤纸过滤或者4000 r/min ，5 min 。移取2 mL 滤液于10 mL 刻度试管中，加4 mL 羧甲基纤维素钠，再移入2 mL PbCl 2，放置1 h ，摇匀。在540 nm 下，以PbCl 2加入蒸馏水做参比测定吸光度E1。

再分别取滤液2 mL 于另一带塞的10 mL 试管中，加入羧甲基纤维素钠4 mL ，0.03 mol/L HCl 2 mL ，在室温下放置2 h ，以蒸馏水加羧甲基纤维素钠做空白，测定吸光值E 2。计算公式为E=E 1-E 2。最终的计算公式为：

硫甙含量（μmol /g ）=0.2+185.2E ，

%100%⨯-=处理前菜粕硫甙含量

处理后菜粕硫甙含量处理前菜粕硫甙含量）硫甙降解率（ 2. 粗蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法，具体方法参见GB 6432-94。

3． 硫甙分解产物ITC 和OZT 的测定

1. 原理

菜粕中的硫甙在pH=7的条件下，可被芥子酶水解生成异硫氰酸酯（ITC ），带有羟基的ITC 在极性溶剂中可自动环化成恶唑烷硫酮（OZT ），ITC 与氨作用

生成的硫脲和OZT在紫外区245 nm处有最大吸收量。

2.试剂和溶液

（1）芥子酶：取外购袋装白芥子碾碎后装入滤纸包中，置索氏抽提器中，加无水乙醚浸过滤包，浸泡12 h，在50℃-60℃水浴锅中回流抽提6 h -8 h提取脂肪。每小时要回流10次左右。取出滤包风干，等乙醚挥发后，在40℃恒温箱中干燥2 h，碾成粉并过60目筛，装入带塞三角瓶中，贮存于干燥器中备用。10 g 经过索氏提取仪脱脂后的芥菜籽粉末，加入30 mL预冷的蒸馏水，于4℃下提取1 h，每隔15 min搅拌一次。而后在4000 r/min下离心10 min，取上清夜加入等体积预冷乙醇，放入冰箱中1 h，离心收集沉淀，用70%冰乙醇洗涤沉淀2次，离心得到粗酶。等乙醇挥发后，加入pH=7的缓冲液30 mL，重新溶解为粗酶液，放冰箱保存。

（2）pH=7磷酸-柠檬酸缓冲液（0.2 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L柠檬酸溶液分别为16.5 mL和3.5 mL混合）

（3）二氯甲烷、95%乙醇、20%氨性乙醇（1 体积氨水加4 体积无水乙醇）

3.产物的测定：取烘干样200 mg，放于10 mL离心管中，每管加入2 mL粗酶液，轻摇匀于40℃保温2 h；加入5 mL二氯甲烷，充分提取毒素1 h，4000 r/min 下离心20 min。用100 μL微量注射器抽取最下层含有酶解产物异硫氰酸酯的二氯甲烷吸收液两份：一份加入事先装有6.0 mL 95%乙醇溶液的10 mL 磨口试管中，一份加入装有20%氨水的乙醇溶液试管中，将两试管加塞密闭并置于50℃恒温水浴锅中反应2 h，反应结束后冷却，然后分别以100 μL二氯甲烷加6.0 mL 20%氨水乙醇溶液和100 μL二氯甲烷加6.0 mL 95%乙醇溶液作空白，用紫外分光光度计分别测定ITC和OZT在235 nm、245 nm、255 nm波长处的光密度（OD）。再按下列公式计算出硫甙的含量：

硫甙= OZT + ITC（mg/g）

OZT = OD245校×22. 1（mg/g）

ITC = OD245校×28. 55（mg/g）

= OD245-（OD235 + OD255）/ 2

其中OD245

校

注意点：（1）菜粕要过80目筛（2）pH=7.0的缓冲液配制要准确（3）加热时要把样品先放到温度不高的水浴中缓慢加热（4）维持反应体系密闭稳定

4. 单宁的测定

1.原理

采用经典的Folin-Denis法，原理为单宁类物质在碱性条件下能与Folin-Denis 试剂发生反应而生成蓝色的复合物。根据显色的强弱，确定单宁的含量。

2.试剂和溶液

（1）焦没食子酸、甲醇

（2）Folin-Dennis 试剂：钨酸钠100 g 、磷钼酸20 g 溶于200 mL 水中，加入磷酸50 mL ，加热回流2 h ，冷却后，稀释至1 L 。

（3）饱和碳酸钠

3. 测定方法

（1）标准溶液的配制：称0.025 g 焦没食子酸标准品于25 mL 容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。此标准浓度为1.0 mg/mL 。分别吸取标准液0.2 mL ，0.4 mL ，0.6 mL ，0.8 mL ，1.0 mL 配制成浓度为0.02 mg/mL 、0.04 mg/mL 、0.06 mg/mL 、0.08 mg/mL 和0.10 mg/mL 的备用液。

绘制标准曲线：吸取各浓度的标准液0.5 mL ，于10 mL 比色管中，加入0.5 mL Folin-Denis 显色剂，摇动1 min ，加入饱和Na 2CO 3 1 mL ，用水定容到10 mL 刻度，室温放置1 h ，于760 nm 处测定比色值，并绘制标准曲线。

（2）样品中单宁的提取：1 g 菜粕加入20 mL 70%乙醇（pH=2，用HCl 调），在40℃浸提40 min ，而后3000 r/min 离心10 min ，取1 mL 稀释到25 mL ，取0.5 mL 待测。

（3）样品中单宁的测定：取提取液0.5 mL ，加入10 mL 比色管中，加入7 mL H 2O ，0.5 mL Folin 显色剂，剧烈振荡3 min 后，1 mL 饱和Na 2CO 3，充分混和，用水定容至10 mL 刻度，放置1 h 。在760 nm 处测定比色值，再参照标准曲线，得到准确的含量。

5. 小肽含量的测定

1. 原理

三氯乙酸（TCA ）可以去除酸不溶性的蛋白和长链肽沉淀。余下的蛋白为低分子量的小肽类物质和氨基酸。

2. 测定方法：将待测样品过80目筛，等体积加入10%三氯乙酸（TCA ），在160 r/min 下30 min ，而后4000 r/min 离心15 min ，取上清液做适当稀释后用Folin-酚法测定蛋白质总量。

%100%⨯-=处理前的小肽含量

处理前的小肽含量处理后的小肽含量）小肽含量提高率（ 6． Folin-酚法（lorry 法）测定蛋白质总量

1. 原理

蛋白质与碱性铜溶液中的Cu 2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色。在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比。