植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析

第１期
彭远义等： 植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析
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物生产性能， 减少粪便中磷的排放量， 降低磷对环境 的污染 （Ｈｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｌｅｉ ａｎｄ ｓｔａｈｌ， ２００１）。 植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微 生物产生的植酸酶具有良好的开发前景。通过植酸 酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技 术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基 因， 以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质， 从而 降低生产成本， 提高其使用有效性， 已成为世界性的 研究热点之一 （ 姚斌等 ， １９９８； 王红宁等 ， ２００１； Ｅｒｉｃ
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材料和方法
１． １ 培养基 １． １． １ 初筛培养基 １％植酸钙， ３％葡萄糖， ０．５％ ＮＨ４ＮＯ３，０．０５％ ＫＣｌ，０．００３％ ＭｎＳＯ４ ・ ４Ｈ２Ｏ，０．０５％ ＭｇＳＯ４ ・ ７Ｈ２Ｏ， ０．００３％ ＦｅＳＯ４ ・ ７Ｈ２Ｏ， １．４％ 琼脂， ｐＨ ５．５。 １． １． ２ 复 筛 培 养 基 １．５％ 葡 萄 糖 ， ０．３％ 蛋 白 胨 ， ０．２％ （ ＮＨ４） ０．０５％ ＭｇＳＯ４ ・ ７Ｈ２Ｏ， ０．０５％ ＫＣｌ， ２ＳＯ４， ０．００３％ ＭｎＳＯ４ ・ ４Ｈ２Ｏ， ０．００３％ ＦｅＳＯ４ ・ ７Ｈ２Ｏ， ｐＨ ５．５。 １． ２ 试剂 Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶、 ＥｃｏＲ ! 和 Ｐｓｔ ! 购自 ＴａＫａＲａ 公司， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶购自 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司， ＤＮＡ 回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司， 植酸 ! " Ｐ３１６８） 购置 Ｓｉｇｍａ 公司。 １． ３ 菌种和质粒 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） ＤＨ５（ " 西南农业大 学蚕桑学重点实验室保存） ， ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 购自 ＴａＫａＲａ 公司。 １． ４ 植酸酶产生菌的筛选 取土样按传统方法稀释后涂布于固体筛选培养 基， ２８ #培养 ３ ｄ， 挑取透明圈直径与菌落直径之比 较大的菌落， 平板划线法进行分离纯化。 将初筛菌株 接种于液体发酵培养基， ２８ $、 ２２０ ｒ／ｍｉｎ 摇床发酵 ５ ｄ 后， 测定各样品发酵上清液酶活。植酸酶活性的 测定参照张若寒 （１９９７） 报道方法略加改进后进行。 酶活性单位 （ Ｕ） 定义为： 在一定条件下， 每分钟从 ０．００５１ ｍｏｌ／Ｌ 的植酸钠溶液中释放出 １ ｎｍｏｌ 无机磷 所需要的酶量为 １ 个酶活单位。 １． ５ 植酸酶产生菌的鉴定
ｎｉｇｅｒ ０３２１４ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｉｎ ｐＨ １．５ ｔｏ ２．５ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ５０ "． Ｃｕｌ－
ｔｉｖａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｈａｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ， ｔｈｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｔ ３４５Ｕ／ｍＬ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ． Ｔｈｅ ｐｈｙＡ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｈｙｔａｓｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ０３２１４ ｂｙ ＰＣＲ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙＡ ｇｅｎｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ １ ５０６ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｗｉｔｈ ａ １０２ ｂｐ ｉｎｔｒｏｎ， ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ４６７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ． Ａ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ １９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ａｔ ｔｈｅ ５＇ｅｎｄ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｅｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｔａｓｅ． ｐｈｔａｓｅ； Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ０３２１４； ｐｈｙＡ ｇｅｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
参照魏景超（１９９７）方法进行。 １． ６ 植酸酶基因的克隆与分析 １． ６． １ 植酸酶产生菌基因组 ＤＮＡ 的提取 以筛选 出的植酸酶高产菌株黑曲霉 （ Ａ ｓｐｅｒｇｉ ｌ ｌ ｕｓ ｎｉ ｇｅｒ ） ０３２１４ 为供试菌株，采用改良氯化苄法提取其基因 组 ＤＮＡ。 将黑曲霉 ０３２１４ 菌株接种于马铃薯固体培 养基， ２８ %培养 ４８ ｈ，然后转接入马铃薯液体培养 基中， ２８ &摇床培养至长出大量菌丝。 收集菌丝体， 加入液氮研磨成粉末状。 在 １．５ ｍＬ 离心管中加入约 ０．１ ｇ 菌丝粉末和 ５００ #Ｌ ＤＮＡ 抽提液 （ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ， ｐＨ ９．０； ４０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０） ，振荡混 剧烈 ’()*+ １０％ＳＤＳ １００ #Ｌ 和氯化苄 ３００ #Ｌ， 震荡使管内混合物成乳状。５０ ,保温 １ ｈ 后，加入 ３００ #Ｌ ３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ （ ｐＨ ５．０） 混匀，冰水浴 １５ ｍｉｎ， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，收集上清液，加入 ＲＮａｓｅ（ 终 浓 度 为 １００ #ｇ／ｍＬ） ３７ - 消 化 ３０￣６０ ｍｉｎ。酚氯仿抽提 １￣２ 次， 取上清液， 加入等体积无 水乙醇沉淀 ２０ ｍｉｎ， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ， 沉淀 . ７０％乙醇洗涤 ２ 次， ＴＥ 缓冲液溶解 ＤＮＡ。 用紫外 分光光度计和 １％琼脂糖凝胶电泳检测抽提效果。 １． ６． ２ 黑曲霉植酸酶基因的 ＰＣＲ 扩增与回收 引 物 设 计 ： 根 据 ＧｅｎＢａｎｋ 中 已 有 的 黑 曲 霉 植 酸 酶 ｐｈｙＡ 基因序列，并结合已报道的黑曲霉植酸酶 ｐｈｙＡ 基因 ＰＣＲ 引物序列设计引物，由上海生物工 程公司合成。
植酸是一种广泛存在于植物籽实的有机络合 物， 它常和二价或三价阳离子结合形成不溶性盐。 谷 物饲料及其加工产品中 ６０％￣８０％ 的磷以植酸磷 （ 六磷酸肌醇） 形式存在， 单胃动物（ 猪、 禽等）由于 缺乏分解植酸磷所必需的酶而不能有效地利用植酸 磷， 造成磷源浪费， 同时未被消化的植酸磷经动物排 出体外后易造成有机磷富积， 引起环境污染。 植酸还 是一种重要的抗营养因子，它在动物胃肠道消化过
ｐｈｙＡ 基因的完整序列， 基因全长 １ ５０６ ｂｐ， 其中包含一段长 １０２ ｂｐ 的内含子， 编码 ４６７ 个氨基酸， 有 １０ 个潜在的糖基化位点，
５’ 端有一编码 １９ 个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶的进一步研究提供了新的材料。 关键词： 植酸酶； 黑曲霉 ０３２１４； ｐｈｙＡ 基因； 序列分析
上游引物： ５＇ＡＴＡＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＴ３＇； 下游引物： ５＇ＣＡＧＣＴＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＴＣＣＧＣ３＇。
ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｔｏｍｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。本实验通过从土 壤中筛选植酸酶高产菌株，并对其植酸酶基因进行 克隆分析，以期为植酸酶的进一步研究提供新的资 源。
植酸酶基因的扩增与回收：以黑曲霉 ０３２１４ 基 因组 ＤＮＡ 为模板，用 Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶扩增植 酸 酶 ｐｈｙＡ 基 因 。 反 应 体 系 ： Ｂｕｆｆｅｒ ５ #Ｌ， ｄＮＴＰ ４ ＤＮＡ １ #Ｌ， Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶 ０．２５ #Ｌ， 上下 #Ｌ， 游引物各 １#Ｌ， ｄｄＨ２Ｏ ３７．７５ #Ｌ。反应条件： ９４ / ５ ｍｉｎ （ ， ９４ 0 １ ｍｉｎ， ５５ 1 ４５ ｓ， ７２ 2 １．５ ｍｉｎ）!３０， ７２3延伸 １０ ｍｉｎ。扩增产物用 ＤＮＡ 回收试剂盒回 收。 １． ６． ３ 植酸酶基因的克隆 将回收产物两端加 Ａ 后与 ｐＭＤ１８－Ｔ 载体在 ４ 4 下连接过夜。取连接反 应液转化 ＤＨ５" 感受态细胞，涂布于含有 Ａｍｐ、 Ｘ－ｇａｌ和 ＩＰＴＧ 的 ＬＢ 琼脂平板上， ３７ 5培养 ２４ ｈ， 采 用碱裂解法抽提质粒 ＤＮＡ， 并进行电泳检测、 酶切 鉴定和 ＰＣＲ 鉴定。 １． ６． ４ 植酸酶基因的序列测定与分析 所获阳性 克隆菌株质粒 ＤＮＡ 由宝生物工程 （ 大连） 有限公 司进行序列测定，采用相关软件对测序结果进行分
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ０３２１４ Ｓｔｒａｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐｈｙｔａｓｅ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｔｓ Ｐｈｙｔａｓｅ ｐｈｙＡ Ｇｅｎｅ
ＰＥＮＧ Ｙｕａｎ－Ｙｉ１，２＊＊ ＭＡ Ｌｉ－Ｐｉｎｇ２ ＬＩ Ｃｈｕｎ－Ｍｉｎｇ２ ＬＩＵ Ｓｈｅｎｇ－Ｆｅｎｇ２ ＺＨＯＵ Ｚｅ－Ｙａｎｇ１＊＊
＊基金项目： 重庆市科委攻关项目 （ Ｎｏ． ２００１６７５５） 资助。 １９６５ 年生， 博士， 副教授。Ｅ－ｍａｉｌ： ＜ｐｙｙ２００２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ＞． 彭远义： 男， ＊＊ 通讯作者。Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ． Ｅ－ｍａｉｌ： ＜ｚｙｚｈｏｕ＠ｓｗａｕ．ｃｑ．ｃｎ＞． 收稿日期： ２００４－０２－１８ 接受日期： ２００４－０３－２２
Ｃａ２＋、 Ｃｕ２＋、 Ｆｅ２＋ 等以及 程中会与多种金属离子 Ｚｎ２＋、 蛋白质螯合形成相应的不溶性复合物，从而降低动 物对这些营养元素的有效利用。 植酸酶是近年出现的一种新型绿色添加剂， 它 可催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐， 目 前主要用于饲料工业和食品工业，以消除植物性饲 料 （ 或食品） 中植酸的抗营养作用， 提高机体对蛋白 质及多种微量元素的利用率， 促进生长发育， 提高动
农业生物技术学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌபைடு நூலகம்Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，１３ （１）： １０８￣１１３
・ 研究论文 ・
植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析 ＊
２ 彭远义 １， ＊＊
马丽苹 ２ 李春明 ２ 刘生峰 ２ 周泽扬 １＊＊
（ １． 西南农业大学重庆市蚕桑学重点实验室微生物中心， 重庆 ４００７１６； ２． 西南农业大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室， 重庆 ４００７１６） 摘要： 从土壤中筛选到产植酸酶活性较高的黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ）菌株 ０３２１４， 其植酸酶最适 ｐＨ 值为 １．５ 和 ２．５， 最适 温度为 ５０ !， 植酸酶表达量为 ３４５ Ｕ／ｍＬ 发酵液。通过对黑曲霉 ０３２１４ 植酸酶 ｐｈｙＡ 基因进行 ＰＣＲ 扩增， 获得了 １ 条长约 １．５ ｋｂ 的特异性产物。 以 ｐＭＤ１８－Ｔ 为载体， 构建了含有目的基因片段的重组质粒。ＤＮＡ 序列测定表明， 目的基因片段含有植酸酶
Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １０２ ｐｈｙｔａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ． Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ａｃｔｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｍ， ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ０３２１４， ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
（１． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１６， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｒａｇｅ ＆ Ｈｅｒｂｉｖｏｒｅ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１６， Ｃｈｉｎａ）