微生物发酵制柠檬酸论文
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在柠檬酸形成的主要阶段，丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、顺乌头酸及异柠檬酸在细胞中的浓度有什么显著改变，只有柠檬酸本身的浓度有所改变。
有关由糖形成柠檬酸调节方面的研究并不透彻。在由黑曲霉形成的高活性糖酵解系统中，当糖的浓度很高，pH为2-4时，不存在负能量负荷的控制。另外由于存在着一条丙酮酸-羧酸酶支路，强烈的分解作用造成柠檬酸的大量积累。细胞内反应只利用了少量积累的柠檬酸。柠檬酸的外流就阻止了自身中毒的发生。在生产中采用的突变株一般具有乌头酸水化酶和异柠檬酸脱氢酶活性低的特性。
酵母菌利用正烷烃发酵生产柠檬酸具有工业生产价值，在以烷烃为碳源的培养基中接种这些解脂假丝酵母，在26℃好氧培养7d，发酵pH5-6，对烃转化率为100%-130%。酵母菌发酵生产柠檬酸的缺点在于其发酵过程中会有较高的副产物——异柠檬酸积累，但人们可以通过育种手段选育积累异柠檬酸能力弱的突变株予以解决。
3.乌头酸水合酶的调节
乌头酸水合酶催化柠檬酸的分解，此酶合成受阻或失活，导致TCA环阻断是柠檬酸积累的关键原因之一。
4.异柠檬酸脱氢酶的调节
在正常细胞内，柠檬酸可活化异柠檬酸脱氢酶，因而细胞内柠檬酸浓度增加时便加速异柠檬酸的分解，从而使胞内柠檬酸浓度保持稳定。柠檬酸对异柠檬酸脱氢酶的调节是黑曲霉柠檬酸发酵的基础。异柠檬酸脱氢酶还受AMP活化而受ATP的抑制，产酸期内AMP浓度降低而引起异柠檬酸脱氢酶的抑制，使TCA循环微弱。
微生物发酵生产柠檬酸
摘要：
柠檬酸是一种十分重要的化学物质，常用于食品和饮料以及医药、化妆品、洗涤剂以及工业领域。目前其主要通过微生物发酵进行生产，是微生物在工业上应用的代表。
关键词：
柠檬酸 黑曲霉 TCA循环 糖酵解 表面发酵 固体发酵
作者：
正文：
柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，化学名称2-羟基丙三羧酸，分子式为C6H8O7，是生物体重要的代谢产物之一，在自然界中广泛存在，在植物叶子和果实中尤以柠檬、柑橘、梅、李、梨、桃等植物果实中，在动物的骨骼、血液、乳汁、唾液、汗液和尿中以游离柠檬酸状态或以金属盐形式存在。商品柠檬酸为无色半透明晶体，或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭，虽有强烈酸味但令人愉快，稍有一点后涩味。
用处：
我国柠檬酸主要消费于食品和饮料市场，其他消费领域包括医药、化妆品、洗涤剂以及工业领域。。
发酵原料：
几乎含淀粉和可发酵糖的农产品、农产品加工品及其副产品，某些有机化合物以及石油中的某些成分都可以采用。目前，柠檬酸生产工业上使用的原料主要有以下几类：
⑴淀粉质原料 甘薯、木薯、马铃薯及其薯干、薯粉、淀粉及薯渣及玉米粉等。
发酵工艺：
柠檬酸发酵工业生产工艺的发展可分为3个阶段。20世纪20年代的由青霉和曲霉的表面发酵生产为第一阶段；30年代开始的曲霉深层发酵生产为第二阶段；从50年代至今以曲霉深层发酵为主，并进行着表面和固体发酵工艺为第三阶段。但其中还有着含糖基质发酵与烷烃类基质发酵之分。
（1）表面发酵
表面发酵是利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。这种柠檬酸生产工艺发明最早，1923年首先由美国Pfizer公司实现了工业化，至今仍在沿用，主要采用糖蜜原料发酵。具体过程如下：首先将糖蜜中的有害物质除去，再加入必要的营养盐并蒸煮灭菌；调pH至2.2或稍低一点，将该灭菌的培养基放入高度为10-25cm的平盘中，置于事先经一定消毒的发酵室中发酵培养。培养温度为28-30℃，真菌在平面前板上很快形成彼此连接的菌丝体盖。发酵过程中，想培养时吹入相对湿度为45%-60%的无菌空气。2-4d后，柠檬酸快速形成，7-10d发酵结束。表面培养法产酸率一般为10%-20%，对糖转化率为70%-95%。将发酵结束的发酵液抽出，加CaCO3形成柠檬酸钙沉淀下来。采用表面发酵，每平方米浅盘每天大约可生产1kg含一个水分子的柠檬酸。
（2）为降低副产物有机酸如葡萄糖酸和草酸的能力，采用基因工程的手段，构建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶丧失Байду номын сангаас工程菌。
生物合成途径：
普遍认为柠檬酸糖质原料发酵是经EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环而形成的。
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢。虽然也存在HMP酶系，但HMP途径主要在孢子阶段活跃，应为它提供了核酸合成等所需的前体物质。Shu的研究表明约有40%的柠檬酸是通过柠檬酸循环中的二羧酸形成的。Cleland等则认为TCA循环受到强烈干扰。还有一种意见认为，当乌头酸酶和异拧香酸脱氢酶消失时，就出现柠檬酸。而有人却证明柠檬酸酶或需要NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶受到阻断。从黑曲霉的老菌丝体中分离的线粒体可以看到，在柠檬酸大量形成时，TCA循环中其呼吸作用略有减弱。因此可以证明，在柠檬酸形成的主要阶段，存在着乌头酸酶、需NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、富马酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，并对α-氧-戊二酸脱氢酶有抑制作用。
2.柠檬酸合成酶的调节
柠檬酸合成酶是TCA环的起始酶，只对CoA和ATP的调节敏感，ATP-Mg螯合物只起微弱的抑制作用，而其它调节物则无影响，因细胞内ATP是以Mg螯合物形式出现，所以ATP对他影响不太重要，该酶对乙酰CoA的亲和力取决于草酰乙酸的浓度，在柠檬酸积累条件下会使该酶对乙酰CoA亲和力增强。
生产研究历史：
早在1784年，瑞典化学家Scheel就首次从柠檬汁中提取出了柠檬酸，直到上世纪初，这种有机酸仍然绝大多数是从柠檬中提取出来的。1860年，意大利开始用向果汁中加石灰乳方法制柠檬酸，从而进行工业化生产，以意大利的西西里岛最著名。1891年，德国科学家Wehmer就从腐败的柑橘中分离出一种丝状菌，能使含钙的糖液变酸，并从中分离出柠檬酸和草酸。1913年，Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸，1919年和1923年，比利时的一家公司和美国的Ch. Pfizer公司分别成功进行浅盘发酵法大规模生产柠檬酸。后于1952年，美国Miles公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸，并在世界上流行至今。
厚层发酵法要求曲层更加疏松，否则厚层的压实作用会造成部分或全部底层物料板结，难以通风。鉴于此，厚层醅中的水分控制非常重要。
厚层发酵的重要控制仍是温度和湿度。温度控制程序与薄层发酵相似。湿度主要靠通风量和进风湿度加以控制，但在某些设备中可以由水冷装置协助控制。厚层进风的相对湿度都控制在接近100%，以尽量防止水分蒸发，因为厚层培养基中的水分本来就少。曲层厚度在20cm以下时无需翻料，否则一般都配有翻料装置。
（2）固体发酵
固体发酵是将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式。1953年Cahn首先发明了这种方法，但由于其劳动强度太大，未引起重视。1953年日本率先实现工业化，我国的以薯干渣为原料的固体发酵工艺是于1977年成功投产的。固体发酵又有薄层发酵法和厚层通风发酵法之分。其发酵控制规程如下：
主要优点是设备占地面积较小，污染杂菌的可能性较小，机械化程度高，能够形成较大规模的生产规模。
3深层发酵
深层发酵是菌体在液体培养基中，在通气的条件下通过代谢转化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。该工艺是美国公司Miles首先成功工业化的，并被当今普遍应用。我国薯干深层发酵工艺相当简单，糖化液直接由连消器的维持罐输入发酵罐或种子罐中，营养盐用硫铵，种子培养基接种黑曲霉麸曲，在35℃左右通风培养20-30h，接入发酵罐。35℃通风搅拌发酵培养4d。当产酸不再上升，残糖降至0.2%以下时，发酵终止，立即进入提取。
酶的调节：
柠檬酸是微生物好气代谢过程的中间产物，正常情况下在胞内不会积累，况且柠檬酸还可作为黑曲霉的碳源，因此，柠檬酸积累是代谢失调的结果。从理论上推断，积累柠檬酸必须使生成柠檬酸的有关酶系要强大，而柠檬酸后代谢的酶系要微弱，其中糖酵解的调节是柠檬酸发酵最为重要的调节。
在20世纪60年代前后陆续发现，菌体累积柠檬酸时，与合成柠檬酸有关的酶活是增高的。宇佐美等发现在整个柠檬酸发酵周期中，酵解酶系和柠檬酸合成酶始终保持较高的活力。Joshi发现，黑曲霉进入产酸期，合成乙酰CoA和合成草酸乙酰的酶活力增强，这就为柠檬酸的合成提供更多的底物。杜宇柠檬酸累积机制有关酶的调节控制研究中，主要集中在磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的调节上。
1.磷酸果糖激酶（PFK）活性调节
在黑曲霉的EMP途径中，PFK是个调节酶，是柠檬酸合成中的主要调节点。在正常生理条件下，该酶被柠檬酸和ATP抑制，而被无机磷、AMP和铵离子激活，铵离子的存在可有效地解除PFK对胞内柠檬酸积累的敏感性。为了使PFK不受柠檬酸的抑制，则必须变更营养成分的限制与氧的供给。
⑵粗制糖类 粗蔗糖、水解糖、饴糖等。
⑶制糖工业副产品 糖蜜、葡萄糖母液、冰糖母液等。
⑷含正烷烃（主要是10-20碳）较多的石油馏分。
⑸副原料 米糠、麦芽、营养盐类、消泡剂类以及各种产酸促进剂。
几种深层发酵培养基配方如下（按1t培养基计）：
a.蔗糖发酵培养基：
蔗糖200kgNH4NO31.1kg
KCl（1mol/L）MgSO4·7H2O0.25kg
发酵微生物：
能够产生柠檬酸的微生物有很多，在石油原料发酵中主要使用酵母菌，特别是解脂假丝酵母和涎沫假丝酵母，但在工业生产上，以糖质或淀粉质原料直接发酵的主要是曲霉属，有黑曲霉、泡盛酒曲霉、米曲霉、灰绿曲霉最为重要，特别是黑曲霉。
微生物的育种：
（1）为提高葡萄糖进入细胞的代谢活力，进一步增强EMP的代谢流，采用60Coγ射线或EMS等诱变剂诱变育种（致死率为70%-80%）。通过高糖（蔗糖）14%的培养基平板筛选分离出比原株生长更好的突变株，有可能获得己糖激酶和6-磷酸果糖激酶活性更高的菌株；在纤维二糖培养基的平板筛选具有2-脱氢葡萄糖抗性的突变株，有可能获得以淀粉为原料的高产柠檬酸突变株；亦可进一步选育抗金属锰离子、锌离子能力强的突变株。
我国柠檬酸工业解放前是空白，1967年黑龙江平糖建立了我国第一个生产100吨的柠檬酸工厂（以甜菜糖蜜为原料，采用浅盘发酵和钙盐-离子交换法提取工艺）。1968年，用薯干为原料，采用深层发酵法生产柠檬酸的上海酵母厂投产成功。以薯干粉为原料、深层发酵法生产柠檬酸，形成了我国生产柠檬酸的一大特色。1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20%，处于世界领先水平。我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也处于领先水平，优势在于：①我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需将淀粉水解成葡萄糖；②尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64h；③柠檬酸产酸速度大大高于国外水平，平均产酸率是国外的2倍。
HCl（1mol/L）10L水加至1t
b.水解糖发酵培养基：
还原糖 170-180kg NH4NO32.5kg
KH2PO40.3kg MgSO4·7H2O 0.25kg
pH 3.5 加水至1t
c.糖蜜发酵培养基：
处理后的糖蜜含糖250g/L左右，pH6.8-7.0
d.薯干发酵培养基：
薯干粉220kg-280kg液化后加水至1t，pH自然
一般曲房湿度在85%-90%即可。低温季节直接通蒸汽，高温季节在地上洒水即能起到保湿作用。
2厚层通风发酵发
固体厚层发酵是在薄层发酵的基础上发展起来的。它的特点是必须由容器的假底向上通风，以供给氧气和带走热量，机械化程度可以提高。这种工艺目前仍在日本占主要地位，但日本主要在设备方面做了改进，实现了发酵密闭化，操作机械化，和部分自动化。
1薄层发酵法
固体发酵过程，对温度和湿度的控制非常重要。曲醅如室的品温在30-35℃，在胞子发芽和菌丝开始发育时代谢热很少，品温逐渐下降，在此前18h内，品温应维持在27-31℃，18-48h内由于代谢热大量释放，品温可维持在38-43℃。但不得更高，48h后品温很快将至35℃左右，直至发酵结束。
上述适宜的品温主要通过室温加以控制，一般室温控制在26-30℃，而任其品温自然变化，但一般不能超过40℃。另外，上下去盘具有温差所以在发酵40h左右要把上下曲盘对调一下。为减小这种温差，上盘曲层的厚度可以小于下层，整个发酵期内不必翻曲。
有关由糖形成柠檬酸调节方面的研究并不透彻。在由黑曲霉形成的高活性糖酵解系统中，当糖的浓度很高，pH为2-4时，不存在负能量负荷的控制。另外由于存在着一条丙酮酸-羧酸酶支路，强烈的分解作用造成柠檬酸的大量积累。细胞内反应只利用了少量积累的柠檬酸。柠檬酸的外流就阻止了自身中毒的发生。在生产中采用的突变株一般具有乌头酸水化酶和异柠檬酸脱氢酶活性低的特性。
酵母菌利用正烷烃发酵生产柠檬酸具有工业生产价值，在以烷烃为碳源的培养基中接种这些解脂假丝酵母，在26℃好氧培养7d，发酵pH5-6，对烃转化率为100%-130%。酵母菌发酵生产柠檬酸的缺点在于其发酵过程中会有较高的副产物——异柠檬酸积累，但人们可以通过育种手段选育积累异柠檬酸能力弱的突变株予以解决。
3.乌头酸水合酶的调节
乌头酸水合酶催化柠檬酸的分解，此酶合成受阻或失活，导致TCA环阻断是柠檬酸积累的关键原因之一。
4.异柠檬酸脱氢酶的调节
在正常细胞内，柠檬酸可活化异柠檬酸脱氢酶，因而细胞内柠檬酸浓度增加时便加速异柠檬酸的分解，从而使胞内柠檬酸浓度保持稳定。柠檬酸对异柠檬酸脱氢酶的调节是黑曲霉柠檬酸发酵的基础。异柠檬酸脱氢酶还受AMP活化而受ATP的抑制，产酸期内AMP浓度降低而引起异柠檬酸脱氢酶的抑制，使TCA循环微弱。
微生物发酵生产柠檬酸
摘要：
柠檬酸是一种十分重要的化学物质，常用于食品和饮料以及医药、化妆品、洗涤剂以及工业领域。目前其主要通过微生物发酵进行生产，是微生物在工业上应用的代表。
关键词：
柠檬酸 黑曲霉 TCA循环 糖酵解 表面发酵 固体发酵
作者：
正文：
柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，化学名称2-羟基丙三羧酸，分子式为C6H8O7，是生物体重要的代谢产物之一，在自然界中广泛存在，在植物叶子和果实中尤以柠檬、柑橘、梅、李、梨、桃等植物果实中，在动物的骨骼、血液、乳汁、唾液、汗液和尿中以游离柠檬酸状态或以金属盐形式存在。商品柠檬酸为无色半透明晶体，或白色颗粒或白色结晶性粉末，无臭，虽有强烈酸味但令人愉快，稍有一点后涩味。
用处：
我国柠檬酸主要消费于食品和饮料市场，其他消费领域包括医药、化妆品、洗涤剂以及工业领域。。
发酵原料：
几乎含淀粉和可发酵糖的农产品、农产品加工品及其副产品，某些有机化合物以及石油中的某些成分都可以采用。目前，柠檬酸生产工业上使用的原料主要有以下几类：
⑴淀粉质原料 甘薯、木薯、马铃薯及其薯干、薯粉、淀粉及薯渣及玉米粉等。
发酵工艺：
柠檬酸发酵工业生产工艺的发展可分为3个阶段。20世纪20年代的由青霉和曲霉的表面发酵生产为第一阶段；30年代开始的曲霉深层发酵生产为第二阶段；从50年代至今以曲霉深层发酵为主，并进行着表面和固体发酵工艺为第三阶段。但其中还有着含糖基质发酵与烷烃类基质发酵之分。
（1）表面发酵
表面发酵是利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。这种柠檬酸生产工艺发明最早，1923年首先由美国Pfizer公司实现了工业化，至今仍在沿用，主要采用糖蜜原料发酵。具体过程如下：首先将糖蜜中的有害物质除去，再加入必要的营养盐并蒸煮灭菌；调pH至2.2或稍低一点，将该灭菌的培养基放入高度为10-25cm的平盘中，置于事先经一定消毒的发酵室中发酵培养。培养温度为28-30℃，真菌在平面前板上很快形成彼此连接的菌丝体盖。发酵过程中，想培养时吹入相对湿度为45%-60%的无菌空气。2-4d后，柠檬酸快速形成，7-10d发酵结束。表面培养法产酸率一般为10%-20%，对糖转化率为70%-95%。将发酵结束的发酵液抽出，加CaCO3形成柠檬酸钙沉淀下来。采用表面发酵，每平方米浅盘每天大约可生产1kg含一个水分子的柠檬酸。
（2）为降低副产物有机酸如葡萄糖酸和草酸的能力，采用基因工程的手段，构建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶丧失Байду номын сангаас工程菌。
生物合成途径：
普遍认为柠檬酸糖质原料发酵是经EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环而形成的。
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢。虽然也存在HMP酶系，但HMP途径主要在孢子阶段活跃，应为它提供了核酸合成等所需的前体物质。Shu的研究表明约有40%的柠檬酸是通过柠檬酸循环中的二羧酸形成的。Cleland等则认为TCA循环受到强烈干扰。还有一种意见认为，当乌头酸酶和异拧香酸脱氢酶消失时，就出现柠檬酸。而有人却证明柠檬酸酶或需要NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶受到阻断。从黑曲霉的老菌丝体中分离的线粒体可以看到，在柠檬酸大量形成时，TCA循环中其呼吸作用略有减弱。因此可以证明，在柠檬酸形成的主要阶段，存在着乌头酸酶、需NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、富马酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，并对α-氧-戊二酸脱氢酶有抑制作用。
2.柠檬酸合成酶的调节
柠檬酸合成酶是TCA环的起始酶，只对CoA和ATP的调节敏感，ATP-Mg螯合物只起微弱的抑制作用，而其它调节物则无影响，因细胞内ATP是以Mg螯合物形式出现，所以ATP对他影响不太重要，该酶对乙酰CoA的亲和力取决于草酰乙酸的浓度，在柠檬酸积累条件下会使该酶对乙酰CoA亲和力增强。
生产研究历史：
早在1784年，瑞典化学家Scheel就首次从柠檬汁中提取出了柠檬酸，直到上世纪初，这种有机酸仍然绝大多数是从柠檬中提取出来的。1860年，意大利开始用向果汁中加石灰乳方法制柠檬酸，从而进行工业化生产，以意大利的西西里岛最著名。1891年，德国科学家Wehmer就从腐败的柑橘中分离出一种丝状菌，能使含钙的糖液变酸，并从中分离出柠檬酸和草酸。1913年，Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸，1919年和1923年，比利时的一家公司和美国的Ch. Pfizer公司分别成功进行浅盘发酵法大规模生产柠檬酸。后于1952年，美国Miles公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸，并在世界上流行至今。
厚层发酵法要求曲层更加疏松，否则厚层的压实作用会造成部分或全部底层物料板结，难以通风。鉴于此，厚层醅中的水分控制非常重要。
厚层发酵的重要控制仍是温度和湿度。温度控制程序与薄层发酵相似。湿度主要靠通风量和进风湿度加以控制，但在某些设备中可以由水冷装置协助控制。厚层进风的相对湿度都控制在接近100%，以尽量防止水分蒸发，因为厚层培养基中的水分本来就少。曲层厚度在20cm以下时无需翻料，否则一般都配有翻料装置。
（2）固体发酵
固体发酵是将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式。1953年Cahn首先发明了这种方法，但由于其劳动强度太大，未引起重视。1953年日本率先实现工业化，我国的以薯干渣为原料的固体发酵工艺是于1977年成功投产的。固体发酵又有薄层发酵法和厚层通风发酵法之分。其发酵控制规程如下：
主要优点是设备占地面积较小，污染杂菌的可能性较小，机械化程度高，能够形成较大规模的生产规模。
3深层发酵
深层发酵是菌体在液体培养基中，在通气的条件下通过代谢转化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。该工艺是美国公司Miles首先成功工业化的，并被当今普遍应用。我国薯干深层发酵工艺相当简单，糖化液直接由连消器的维持罐输入发酵罐或种子罐中，营养盐用硫铵，种子培养基接种黑曲霉麸曲，在35℃左右通风培养20-30h，接入发酵罐。35℃通风搅拌发酵培养4d。当产酸不再上升，残糖降至0.2%以下时，发酵终止，立即进入提取。
酶的调节：
柠檬酸是微生物好气代谢过程的中间产物，正常情况下在胞内不会积累，况且柠檬酸还可作为黑曲霉的碳源，因此，柠檬酸积累是代谢失调的结果。从理论上推断，积累柠檬酸必须使生成柠檬酸的有关酶系要强大，而柠檬酸后代谢的酶系要微弱，其中糖酵解的调节是柠檬酸发酵最为重要的调节。
在20世纪60年代前后陆续发现，菌体累积柠檬酸时，与合成柠檬酸有关的酶活是增高的。宇佐美等发现在整个柠檬酸发酵周期中，酵解酶系和柠檬酸合成酶始终保持较高的活力。Joshi发现，黑曲霉进入产酸期，合成乙酰CoA和合成草酸乙酰的酶活力增强，这就为柠檬酸的合成提供更多的底物。杜宇柠檬酸累积机制有关酶的调节控制研究中，主要集中在磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的调节上。
1.磷酸果糖激酶（PFK）活性调节
在黑曲霉的EMP途径中，PFK是个调节酶，是柠檬酸合成中的主要调节点。在正常生理条件下，该酶被柠檬酸和ATP抑制，而被无机磷、AMP和铵离子激活，铵离子的存在可有效地解除PFK对胞内柠檬酸积累的敏感性。为了使PFK不受柠檬酸的抑制，则必须变更营养成分的限制与氧的供给。
⑵粗制糖类 粗蔗糖、水解糖、饴糖等。
⑶制糖工业副产品 糖蜜、葡萄糖母液、冰糖母液等。
⑷含正烷烃（主要是10-20碳）较多的石油馏分。
⑸副原料 米糠、麦芽、营养盐类、消泡剂类以及各种产酸促进剂。
几种深层发酵培养基配方如下（按1t培养基计）：
a.蔗糖发酵培养基：
蔗糖200kgNH4NO31.1kg
KCl（1mol/L）MgSO4·7H2O0.25kg
发酵微生物：
能够产生柠檬酸的微生物有很多，在石油原料发酵中主要使用酵母菌，特别是解脂假丝酵母和涎沫假丝酵母，但在工业生产上，以糖质或淀粉质原料直接发酵的主要是曲霉属，有黑曲霉、泡盛酒曲霉、米曲霉、灰绿曲霉最为重要，特别是黑曲霉。
微生物的育种：
（1）为提高葡萄糖进入细胞的代谢活力，进一步增强EMP的代谢流，采用60Coγ射线或EMS等诱变剂诱变育种（致死率为70%-80%）。通过高糖（蔗糖）14%的培养基平板筛选分离出比原株生长更好的突变株，有可能获得己糖激酶和6-磷酸果糖激酶活性更高的菌株；在纤维二糖培养基的平板筛选具有2-脱氢葡萄糖抗性的突变株，有可能获得以淀粉为原料的高产柠檬酸突变株；亦可进一步选育抗金属锰离子、锌离子能力强的突变株。
我国柠檬酸工业解放前是空白，1967年黑龙江平糖建立了我国第一个生产100吨的柠檬酸工厂（以甜菜糖蜜为原料，采用浅盘发酵和钙盐-离子交换法提取工艺）。1968年，用薯干为原料，采用深层发酵法生产柠檬酸的上海酵母厂投产成功。以薯干粉为原料、深层发酵法生产柠檬酸，形成了我国生产柠檬酸的一大特色。1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20%，处于世界领先水平。我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也处于领先水平，优势在于：①我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需将淀粉水解成葡萄糖；②尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64h；③柠檬酸产酸速度大大高于国外水平，平均产酸率是国外的2倍。
HCl（1mol/L）10L水加至1t
b.水解糖发酵培养基：
还原糖 170-180kg NH4NO32.5kg
KH2PO40.3kg MgSO4·7H2O 0.25kg
pH 3.5 加水至1t
c.糖蜜发酵培养基：
处理后的糖蜜含糖250g/L左右，pH6.8-7.0
d.薯干发酵培养基：
薯干粉220kg-280kg液化后加水至1t，pH自然
一般曲房湿度在85%-90%即可。低温季节直接通蒸汽，高温季节在地上洒水即能起到保湿作用。
2厚层通风发酵发
固体厚层发酵是在薄层发酵的基础上发展起来的。它的特点是必须由容器的假底向上通风，以供给氧气和带走热量，机械化程度可以提高。这种工艺目前仍在日本占主要地位，但日本主要在设备方面做了改进，实现了发酵密闭化，操作机械化，和部分自动化。
1薄层发酵法
固体发酵过程，对温度和湿度的控制非常重要。曲醅如室的品温在30-35℃，在胞子发芽和菌丝开始发育时代谢热很少，品温逐渐下降，在此前18h内，品温应维持在27-31℃，18-48h内由于代谢热大量释放，品温可维持在38-43℃。但不得更高，48h后品温很快将至35℃左右，直至发酵结束。
上述适宜的品温主要通过室温加以控制，一般室温控制在26-30℃，而任其品温自然变化，但一般不能超过40℃。另外，上下去盘具有温差所以在发酵40h左右要把上下曲盘对调一下。为减小这种温差，上盘曲层的厚度可以小于下层，整个发酵期内不必翻曲。