宏基因组
基于第二代高通量测序的
宏基因组学解决方案及其应用
傅赟彬
market@https://www.360docs.net/doc/f313096197.html,
宏基因组的概念
?宿主相关：
z人：皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等
z动植物：肠道、瘤胃、共生系统
?环境相关：
z自然环境：土壤、水体、空气
z深海、火山区、盐湖、沼泽等
z活性污泥、污水处理、生物反应器、石油
宏基因组学（Metagenomics）最早于1998年提出，以样品中
的微生物群落作为整体进行研究的学科，解释微生物群落多样性
与种群结构等之间的关系。
?Roche 454 焦磷酸测序?Illumina 边合成边测序?Life technology 连接测序
宏基因组学主要研究方法
主要研究方法
基因克隆文库DNA 指纹图谱技术高通量测序技术?变性梯度凝胶电泳（DGGE ）?末端片段长度多态性（T-RFLP ）
?单克隆质粒?转化细胞构建?Sanger 双脱氧法测序宏基因组学引入了宏观生态的研究理念，对环境中微生物菌群的多样性、功能活性等宏观特征进行研究，可以更准确地反映出微生物生存的真实状态。
宏基因组的研究内容
宏基因组环境微生物多样性检测
宏基因组的de novo 测序
对指定环境中微生物16S rDNA 高变区/ITS 的PCR 扩增产物的高通量测序，分析该环境下微生物群落的多样性。
对环境样品中的微生物群落及其相互关系进行高
通量测序，经过序列组装和基因注释之后，完成宏基
因组的全基因组分析。
宏基因组实验流程
环境样品
提取基因组DNA
16S rDNA 可变区
/ITS PCR 富集基因组DNA 片段化
构建测序文库
Roche 454 FLX+/Illumina 上机测序
数据质控
高质量测序数据
生物信息学分析
宏基因组的高通量测序
Eel river sediment US, JGI Termite gut
US, JGI
Cow rumen
US, JGI
Soil US, JGI HMP US, NIH Human gut EU Human gut Japan Human gut US, WU Mouse gut
US, WU
环境微生物多样性的检测
环境微生物多样性检测——16S rDNA
研究对象：细菌或古菌。
?提供样品中微生物分类的一个很好的标记方法。
?非常适合对整个或者独立微生物样本进行生物多样性及生态特征的研究。
案例1-不同饮食对肠道微生物的影响
De Filippo. PNAS, 2010. 107(33): 14691-14696.
非洲农村儿童（BF ）的饮食主要由高纤维、高淀粉、素食等为主
意大利儿童（EU ）的饮食具有典型的西方特色，高脂、高蛋白的食品。背景：目的：利用Roche 454测序平台检测14个健康的BF 和15个健康的EU 粪便样本
DNA 中16S rDNA V5-V6区，了解饮食对肠道微生物群落多样性的影响。
案例1-不同饮食对肠道微生物的影响
结果：
?欧洲儿童EU 群体中厚壁菌门细菌为优势菌群＞50%
?非洲儿童BF 群体中拟杆菌门细菌为优势菌群＞70%
?产生纤维素酶和木聚糖水解酶的Prevotella 和Xylanibacter 菌株只存在于BF 中，且比例高。
?饮食习惯对肠道菌群的定植有显著影响。
案例2-人类“肠型”的研究
作为与人类健康息息相关的人体肠道微生物，是否能以这些微生物的多
样性来划分不同的肠型是一个值得探讨的问题。
背景：目的：Arumugam, M., et al . Nature, 2011. 473(7346): 174-180.利用Illumina 和Roche 454测序平台对不同年龄、体重、性别及国籍的人
群肠道微生物多样性进行研究。案例2-人类“肠型”的研究
结果：
?人体胃肠道微生物区系并不是随机组合而成的。
?受检人群中大致可以分为三种类型：拟杆菌型（Bacteroides ）、普氏菌型（Prevotella ）、瘤胃球菌型（Ruminococcus ）。
?分型方法和人体的年龄、体重、性别或国籍都没有任何关联。
Arumugam, M., et al . Nature, 2011. 473(7346): 174-180.
案例3-不同人群肠道微生物多样性
背景：目的：结合Illumina 和Roche 454 测序平台，对来自非洲、南美和美国的531份
人类粪便样本展开了研究。
人类不同发育阶段、生理状态、文化传统和居住地理位置对于个体中的
微生物群有着不同程度的影响。
Yatsunenko, T., et al. Nature, 2012. 486: 222–227.
结果：
?印第安人和马拉维人具有更丰富的肠道微生物多样性。
?三种人们的微生物群的代谢功能是相似的。
?维生素生物合成与年龄呈相关性改变。
?婴幼儿肠道微生物往往携带更多与叶酸生物合成相关的基因
?老年人的肠道微生物则含有更多叶酸代谢相关的基因。
Yatsunenko, T., et al. Nature, 2012. 486: 222–227.案例3-不同人群肠道微生物多样性
宏基因组的de novo 测序
Raw
data
Clean reads
去接头和低质量reads
De novo 组装
ORF
基因预测
功能注释&物种注释PCA 分析聚类分析
宏基因组的de novo 测序
总环境DNA 提取Shougun 文库构建?得到样品中所有基因的无偏好序列数据；
?功能基因与基因功能的综合评价，对动植物的疾病诊断与营养状况研究有着巨大的价值。……
案例1-牛瘤胃中微生物的宏基因组研究
纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物资源。牛在反刍过程中涉及背景：
到纤维素的降解酶，这将为寻找可用于生产生物燃料的酶奠定基础。目的：采用Illumina平台对牛瘤胃消化72 h后的纤维素样品中微生物进行分析。
案例1-牛瘤胃中微生物的宏基因组研究
结果：
?分析得到268 Gb的宏基因组数据。
?将部分基因导入细菌，然后由这些细菌产生了90种蛋白质酶。
?27,775个碳水化合物活性酶基因。
?15个高丰度不可培养微生物基因组。
?人体是由真核细胞与体内共生的微生物共同组成
的“超级生物体（Super organism ）”；
?正常人体肠道中存在约1000-1500种细菌；
?重量1-1.5 kg ；
?微生物数量是人体细胞总数的10倍；
?微生物基因数量是人类基因数量的100多倍。
案例2-人肠道微生物宏基因组研究
Joshua Lederberg
案例2-人肠道微生物宏基因组研究
利用Illumina 测序平台对124 例欧洲人的肠道宏基因组进行研究。
Qin, J., et al .Nature, 2010. 464(7285): 59-65.背景：目的：人体除受自身基因的调控外，还受到大量的共生微生物的影响。目前，
这些肠道微生物中绝大部分序列的意义和基因的功能还没有被阐释清楚。
案例2-人肠道微生物宏基因组研究
结果：
?产生576.7 Gb的数据。通过对功能基因的预测和解析，在全部DNA
序列中找到了330 万个基因，是人体自身基因数目的约150倍。
?每个个体的肠道菌群所包含的基因数目为536,112±12,167 个。
?炎症性肠炎患者肠道菌群中的基因数目平均比健康人少约25%。
2011年《Science》十大科学进展
人肠道微生物的宏基因组Science.334 (6063): 1629-1635
Illumina MiSeq 针对单V 区的测序
Illumina MiSeq
https://www.360docs.net/doc/f313096197.html,/newsf/2012-4/2012428150708852.htm
Roche 454 FLX+平台3个V 区的测序
Roche 454 FLX+
仪器型号性能比较
最长读长平均读长最大reads 细菌检测（16S rDNA ）真菌检测
单V 区2V 区3V 区ITS1/ITS2ITS 全长Roche 454
FLX 600bp 400bp 1M √√╳√╳Roche 454
FLX+1000bp 700bp 1M √√√√√
单V区与多V区宏基因组测序的比较
不同V区鉴定序列和OTU归类至属比例
z同一样品多V区测序的有效数据要远高于单V区，且更为准确。
z OTU定位至属的比例提高了20.72%；Reads定位至属的比例提高了8.55%
V3/V4区V1~V3区/V4~V6区
派森诺生物宏基因组项目
测序项目已完成项目进行中项目
宏基因组
鸡肠道宏基因组人肠道宏基因组
骆驼肠道宏基因组痛风病人肠道宏基因组蜜蜂肠道宏基因组服药后肠道宏基因组土壤宏基因组根际土壤宏基因组…………
宏基因组测序样品要求
样品质量要求：A260/A280应在1.8至2.0之间；电泳检测无明显RNA条带，基
因组条带清晰、完整。
样品浓度要求：浓度不低于50ng/ul；样品总量不低于5ug。
请仔细填写宏基因组测序样品信息表，提供DNA样品编号、数量、浓度、体
积、制备时间、溶剂名称及物种来源。并且请同时提供质量检测相关数据和图片，
包括分光光度、电泳胶图或Nanodrop仪器检测数据。对宏基因组DNA样品，请同
时提供大致的DNA提取方法。
样品中有腐植酸、血红蛋白等抑制因子的残留，往往对PCR带来非常大的麻烦，且很难去除，因此特别要求，客户提供的样品一定要将PCR反应抑制因子去除干净。
样品包装：对DNA样品，我们建议使用1.5ml离心管装载样品，并且用封口膜
密封。并请在各样品管上做好清楚的标识，最好写在标签纸上，贴在管壁。
样品运输：DNA样品请用干冰或者冰袋运输。干冰运输时间不要超过72小时；
冰袋运输，时间最好不要超过24小时。
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样本准备应该遵循的基本原则
?代表性原则
取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的
慎重选择您的取样方案。病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不
能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、
处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。
?准确性原则
代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、
制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。
?迅速性原则
样本质量是影响实验结果的最为关键因素，因此在采集、制备、贮存、运输
过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。
?低温原则
所取样本离体后，应立即置于液氮中，并保证在实验前始终处于-80℃以下，
以避免RNA的降解。
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常见问题
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1、Q: 进行宏基因组de novo 测序时有哪些注意事项？
A: 高质量的总DNA 是确保宏基因组de novo 测序成功的最基本要素。
?样品采集：样品采集条件的一致是最为重要的环节。严格按照采样标准采样，采样后立即封存样品冷冻保存。
?样品DNA ：环境因素异常复杂，许多物质或抑制因子影响后续PCR 、测序文库构建和序列测定，常规提取方法不一定适合，建议按公司要求采用专用试剂盒提取。提供的是DNA 样品，那么需要进行凝胶电泳图，
如果符合相应的要求，将安排后续的上机测序实验。样品质量要求：A260/A280在1.8-2.0之间。
电泳检测无明显RNA 条带，基因组条带清晰、完整；
样品浓度要求：浓度≥50 ng/μl ；样品总量≥5 μg 。
高质量的DNA 胶图低质量的DNA 胶图常见问题
322、Q: 寄送样品过程中的注意事项？哪些关于宏基因组方面的服务？
A: 如果老师在提取DNA 方面存在一些难处，我们会提供提取DNA 的服务，提取的费用一般是在300 元/样品。其中包括水、土壤、污泥以及肠道内容物。z 肠道内容物：2-3g ，干冰运输。
z 海泥/土壤10-20 g ，冰袋运输。
z 水1-5 L ，冰袋运输。
运输过程尽量不要使用玻璃瓶等容器盛放。
发货时间最好在周一至周三，避免样品在周末抵达公司。
天气炎热，最找选择质量可靠的快递进行递送。
常见问题
3、Q: 预付款形式与全款的支付方式？
A:①项目费用≥5万元，可以按照80%的比例支付预付款，待项目完成以后，
老师再支付20%的比例。
②项目费用＜5万元，需要跟老师沟通，尽量一次性支付所有的费用。
4、Q: 发票如何开取？能够换发票？
A:正常的发票内容为“测序”，遇到特殊情况，可在一定范围内满足老师的
要求（比如试剂等），询问老师是否需要他来罗列清单，如果老师让我们来列清
单的话，与财务沟通后，附上清单内容，盖章确认。
如果遇到合作伙伴报销的问题，可以将发票寄回，进行相应的拆分，便于
老师报销。
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常见问题
5、Q: 宏基因组的测序及信息分析周期多长？
A:预付款到账后，我们开始启动项目，一般30-40个工作日完成项目的测序和
生物信息学分析，随后整理项目结题报告，并且刻录光盘，寄送给老师。
6、Q: 实验是否需要重复？
A:根据具体实验方案，一般选取3次以上重复。即是每个处理有3个平行，这
样更能反映样品的真实情况。
7、Q: 宏基因组de novo测序对测序平台有什么要求？
A:Illumina Hiseq2000适合进行基因集的分析，要求每个样本测序量达到3G以上；
Roche 454 FLX+长读长特性更适合新基因组序列的发现，更容易实现基因组
拼接。
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Thank you
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