胶体金标记流程

（一）原理
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。

胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如柠檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。

胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。

根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。

（二）器皿及试剂的处理
1.玻璃器皿的清洁
制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。

如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。

我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。

通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。

也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大小颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。

2.试剂的配制要求
（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

（2）氯化金（HAu Cl4）水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。

放在4℃冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。

（三）胶体金的制备
1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。

氯金酸（HAu Cl4）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。

根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备～150nm不等的胶体金。

最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。

具体操作方法如下：
（1）将HAuC14先配制成％水溶液，取100ml加热至沸。

（2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液。

（3）继续加热煮沸15min。

此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。

全过程约2～3min。

（4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。

用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。

金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。

表1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。

表1 四种粒径胶体金的制备及特性
注意事项：
（1）易潮解，应干燥、避光保存。

（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。

（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水（18M）。

（4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。

最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。

（5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。

因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。

良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。

在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。

当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。

制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。

胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如％NaN3）可有利于保存。

保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。

少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

影响胶体金颗粒大小的因素
如果有较多的大小不等的金颗粒及有椭圆形，三角形金颗粒存在应重新制备。

一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入，而是多次加入。

再者搅拌不均匀，速度太慢没有搅拌起来，造成了颗粒大小不等。

制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。

制备了合格的胶体金以后，放在室温或4℃保存。

避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。

胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。

冰箱内半年左右。

根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在20天以内进行标记。

（三）胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。

如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。

除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。

1．待标记蛋白溶液的制备：
将待标记蛋白预先对L NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。

2．待标胶体金溶液的准备：
以L K2CO3或L HCl调胶体金液的pH值。

标记IgG时，调至；标记McAb时,调至；标记亲和层析抗体时，调至；标记SPA时，调至～；标记ConA时，调至；标记亲和素时，调至9～1 0。

由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸
测定为宜。

3．胶体金与标记蛋白用量之比的确定：
（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。

（2）将标记蛋白（以IgG为例）以L 硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。

对照管只加1ml稀释液。

（3）5min后，在上述各管中加入 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。

（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。

以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。

4．胶体金与蛋白质（IgG）的结合：
将胶体金和IgG溶液分别以L K2CO3调pH至，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。

常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。

加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。

5．胶体金标记蛋白的纯化
（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。

用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5 nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。

然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。

仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。

如在结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。

为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

（2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。

将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1／5～1／10。

再经1 500r/min离心2 0min。

取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。

层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1／10，以L PBS液洗脱（内含％BSA，％NaN3，者用IgG 标记物），流速为8ml/h。

按红色深浅分管收集洗脱液。

一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。

继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。

将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。

最终可得到70％～80％的产量。

6．胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。

或用醋酸铀复染后观察。

计算100个金颗粒的平均直径。

（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。

用L PBS液（含1％BSA，％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520＝左右。

一般应用液的OD520应为～。

（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。

将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。

（四）胶体金标记技术在免疫学中的应用
胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。

1．液相免疫测定：
将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。

利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。

2．金标记流式细胞术：
胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。

而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。

3．胶体金固相免疫测定法：
（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。

将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。

此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IG S／IGSS）。

（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。

在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。

此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。