人诱导性多能干细胞的建立,鉴定与维持+201...
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中国科学院 广州生物医药与健康研究院 GIBH.CAS
人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 何时传代 一般来说，日常传代不要超过一周，因为太大 的克隆中间容易分化，导致下一代分化克隆变多。 若是克隆中间开始发黄，就应该立即传代。 传代时接种细胞的密度要合适。 一般经验是，无饲养层条件下四天传代，有饲 养层条件六天传代。要是传代时克隆汇合度不高， 可以缩小传代比例。
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 饲养层细胞的选择和密度
小鼠胚胎成纤维细胞CF-1、CD1/ICR，以及其他 有报道的品系。 某些人成纤维细胞，可以参照已发表的细胞系， 也可以开发新的。 饲养层细胞的密度要适中：过密时接种的人诱导 性多能干细胞不易贴壁，并且生长缓慢，培养基 营养消耗多快；过稀时对多能干细胞的支持能力 不够，会导致细胞分化。需要自己摸索调整。
多能性
自我更新
无限扩增
James A. Thomson 1998
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背景介绍-成体干细胞
• 成体干细胞是指存在于一种已 经分化组织中的未分化细胞， 这种细胞能够自我更新并且能 够特化形成组成该类型组织的 细胞。成体干细胞存在于机体 的各种组织器官中。成年个体 组织中的成体干细胞在正常情 况下大多处于休眠状态，在病 理状态或在外因诱导下可以表 现出不同程度的再生和更新能 力。
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第三部分 人诱导性多能干细胞的维持
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 日常维护不推荐使用抗生素 一旦建立起人诱导性多能干细胞，获得一定数 量的培养物后，就应该停止使用抗生素了，这也 包括在制备饲养层细胞时不添加抗生素。这样可 以及时发现污染，避免可能存在的污染物对细胞 的长期影响。 • 定期做支原体检测，保证入库保存的诱导性多能 干细胞无支原体污染。
GIBH.CAS
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人诱导性多能干细胞鉴定 -形态鉴别和AP染色
On feeder (100×) AP staining(40×) Matrigel (200×)
扁平，较高核质比 AP染色呈阳性
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人诱导性多能干细胞鉴定
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Day 4 Day 30 AP stain GFP On feeder SKOM Pick up AP staining C20P1 Colonies
部分结果展示
C20P6 No feeder
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第二部分 人诱导性多能干细胞的鉴定
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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人诱导性多能干细胞的建立 -多能性因子的选择
各式各样的“鸡尾酒”
OCT4+SOX2+KLF4+cMYC (2007 Cell) OCT4+SOX2+NANOG+LIN28 (2007 Science) OCT4+SOX2+cMYC (2008 NBT) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+SV40LT+TERT (2008 Nature) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+NANOG+LIN28 (2008 Cell research) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+NANOG+LIN28+SV40LT (2009 Science) OCT4 (2009，2010) 现在，这些转录因子的小分之替代物已经相继被报道出来。 无需转录因子，仅依靠miRNA也可也实现重编程（2011 Cell Stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 细胞复苏率低 是正常的，所以冻存的时候尽可能多冻一些。 我们现在采用冻存Matrigel上的克隆，复苏 时成活率一般可达50%左右，与Y27632联合使用会 提高复苏成活率。 但是前提是冻存时细胞状态要好。建议专门冻 存细胞，不要冻实验剩下的。
多能干细胞
Oct4 Sox2 Klf4 cMyc
Yamanaka S 2007 体细胞
Oct4 Sox2 Nanog Lin28 Yu JY & Thomson JA 2007
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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背景介绍： 人诱导性多能干细胞技术的前景
人诱导性多能干细胞的应用： 1. 疾病模型，研究疾病发生，搭建 筛药平台。 2. 细胞治疗 “用你的细胞定做器官” （Konrad Hochedlinger，《环球科学》 2010）
• 培养方法的改进 低氧 5% O2（2009 Cell stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的建立-技术流程
• 流程图
Cell Stem Cell,2009
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人诱导性多能干细胞的建立-克隆挑取
神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 内皮干细胞 „„
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背景介绍： 细胞核的全能性-体细胞重编程研究
核移植 技术 细胞融 合技术 直接导入外源多 能性因子的重编 程技术
Shinya Yamanaka 2006,2007
Sir John Bertrand Gurdon 1962
Masa Tada 2001
带有多能性选择标记的 小鼠（Fbx-,Oct4-, Nanog- geo) Oct4Oct4 Sox2 Myc Klf4
病毒感染/抗性选择
胚胎材料，伦理问题
带有选择标记的成体细胞
iPSCs
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背景介绍： 人诱导性多能干细胞技术的诞生
46XX
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人诱导性多能干细胞鉴定
-拟胚体畸胎瘤形成实验验证分化潜能
iPS EB Day5
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人诱导性多能干细胞鉴定
- 基因芯片显示与胚胎干细胞的相似程度
iPS-1
iPS-2
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可挑克隆-有光滑边缘，胚胎干细胞样
一次性玻璃巴氏吸管， 需制备圆口（切割， 剥离）和断口（吸取） 两种
处理好 的巴氏 吸管
口吸管
灭菌枪头
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人诱导性多能干细胞的建立 -克隆的扩大培养
• 开始一到两代的时候建议使用机械法传代。若是 克隆均一性不好，需要挑取形态好的亚克隆继续 传代。 • 克隆数量较多，均一性好，且都具有良好的形态 时可以用酶法（dispase /Collagenase IV）开始 传代，扩大培养。
人诱导性多能干细胞的建立、鉴 定与维持
华南干细胞与再生医学研究所 中国科学院广州生物医药与健康研究院 讲解：陈燊（chen_shen@) 2011-8-24
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概
要
• 第一部分 人诱导性多能干细胞的建立 • 第二部分 人诱导性多能干细胞的鉴定 • 第三部分 人诱导性多能干细胞的维持 • 第四部分 开放性讨论
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 无饲养层培养还是有饲养层培养？ Matrigel/ECM与mTeSR1联合使用可以支持人胚 胎干细胞的生长，可以支持人诱导性多能干细胞。 成分清楚，批次间差异小，操作方便，但是成本 较高。 饲养层培养方式是较传统的方式，成本较无饲 养层方式低廉，但需要制备优质的饲养层细胞。 • bFGF用量 4ng/ml-100ng/ml都有人在使用，主要 由不同生产者的bFGF 对细胞的支持效果决定，需 要自己摸索。
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人诱导性多能干细胞的建立 -诱导体系的选择
• 传统的胚胎干细胞培养条件能够支持体细胞完 成重编程，成为诱导性多能干细胞，但是效率 低。 • 一些小分子化合物的加入可以加速重编程过程， 并且可以提高重编程的效率。
VPA（2008 NBT） Vc（2009 Cell Stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 细胞团还是单细胞
越来越多的文献在报道将人胚胎干细胞制备成 单细胞进行传代，与ROCK inhibitor(Y27632)使 用是可以的，但是这种情况一般适用于均一无分 化的克隆传代。单细胞传代时需要较高的接种密 度。通常我们接种10,000cells/cm2. • ROCK inhibitor(Y27632) 工作浓度为10uM，可以促进细胞贴壁。接种时 使用，直接加到培养集中。看到两三个细胞成团 时可以撤掉。
-qPCR检测内源多能性基因与转基因表达水平
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人诱导性多能干细胞鉴定 -多能性标志物的检测
TRA-1-81
SSEA4
TRA-1-60
Nanog
SSEA3
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人诱导性多能干细胞鉴定 -甲基化水平检测与核型鉴定
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人诱导性多能干细胞鉴定
• • • • • • • • • 形态鉴别与AP染色 Realtime PCR 检测多能性基因的表达水平。 免疫荧光鉴定胚胎标志物的表达 多能性基因（Nanog, Oct4）启动子甲基化水平比较 基因芯片鉴定诱导性多能干细胞与胚胎干细胞在基因表达 谱上的相似程度 核型鉴定 拟胚体实验验证分化潜能 畸胎瘤实验验证分化潜能 定向分化实验验证与应用（可选）
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人诱导性多能干细胞的建立 -体细胞的选择
• 方便取材，易获得 • 没有感染传染病，例如HIV,HBV等 • 传代代数较早
但是，值得注意的是不同体细胞来源的诱导性多能干细胞可 能存在分化潜能的差异，研究证实了表观遗传学的“记忆” 存在。这些“记忆”可能会使这种诱导性多能干细胞更容 易分化成它来源的那一类型的细胞。
成纤维细胞（2007） 角化细胞（2008） 羊水细胞（2009）神经前体细胞（2009） 脂肪干细胞（2009）
2008 NBT 2009 HMG
2007 Cell
Peripheral blood cells isolated from blood (2010)
Urine Kidney (2011)
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人诱导性多能干细胞的建立 -多能性因子的选择
• 根据不同实验室的条件 • 根据不同细胞的需要 • 根据不同实验的需要
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人诱导性多能干细胞的建立 -导入系统的选择
非整合的病毒导入系统（2009 Nature, 2009 Cell） 基于转座子(piggyBac)的质粒导入系统（2009 Nature） 基于随体的质粒（episomal plasmid）导入系统 (2009 Nature) 直接用重组蛋白建立诱导性多能干细胞（2009 Cell） 直接导入多能性因子的mRNA（2010 BBRC, 2010, Cell Stem Cell）
优势：不使用胚胎来源材料，规避 伦理问题。 自体移植没有免疫排斥效应。
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Байду номын сангаас
构建人诱导性干细胞的要领
• • • • 用什么细胞？ 用什么因子组合？ 用什么导入手段？ 需不需要特殊的添加剂？
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人诱导性多能干细胞的建立 -体细胞的选择
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第一部分 人诱导性多能干细胞的建立
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背景介绍：人胚胎干细胞
• 胚胎干细胞（ES细胞）来源 于哺乳动物胚胎发育早期的 胚泡（Blastocyst）期的内 细胞团（ICM），是最原始 的干细胞，位于个体发育的 顶端，具有发育的全能性， 能够分化为组成机体的所有 细胞类型，并具发育成完整 个体的能力。
人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 何时传代 一般来说，日常传代不要超过一周，因为太大 的克隆中间容易分化，导致下一代分化克隆变多。 若是克隆中间开始发黄，就应该立即传代。 传代时接种细胞的密度要合适。 一般经验是，无饲养层条件下四天传代，有饲 养层条件六天传代。要是传代时克隆汇合度不高， 可以缩小传代比例。
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 饲养层细胞的选择和密度
小鼠胚胎成纤维细胞CF-1、CD1/ICR，以及其他 有报道的品系。 某些人成纤维细胞，可以参照已发表的细胞系， 也可以开发新的。 饲养层细胞的密度要适中：过密时接种的人诱导 性多能干细胞不易贴壁，并且生长缓慢，培养基 营养消耗多快；过稀时对多能干细胞的支持能力 不够，会导致细胞分化。需要自己摸索调整。
多能性
自我更新
无限扩增
James A. Thomson 1998
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背景介绍-成体干细胞
• 成体干细胞是指存在于一种已 经分化组织中的未分化细胞， 这种细胞能够自我更新并且能 够特化形成组成该类型组织的 细胞。成体干细胞存在于机体 的各种组织器官中。成年个体 组织中的成体干细胞在正常情 况下大多处于休眠状态，在病 理状态或在外因诱导下可以表 现出不同程度的再生和更新能 力。
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第三部分 人诱导性多能干细胞的维持
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 日常维护不推荐使用抗生素 一旦建立起人诱导性多能干细胞，获得一定数 量的培养物后，就应该停止使用抗生素了，这也 包括在制备饲养层细胞时不添加抗生素。这样可 以及时发现污染，避免可能存在的污染物对细胞 的长期影响。 • 定期做支原体检测，保证入库保存的诱导性多能 干细胞无支原体污染。
GIBH.CAS
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
人诱导性多能干细胞鉴定 -形态鉴别和AP染色
On feeder (100×) AP staining(40×) Matrigel (200×)
扁平，较高核质比 AP染色呈阳性
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人诱导性多能干细胞鉴定
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Day 4 Day 30 AP stain GFP On feeder SKOM Pick up AP staining C20P1 Colonies
部分结果展示
C20P6 No feeder
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第二部分 人诱导性多能干细胞的鉴定
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人诱导性多能干细胞的建立 -多能性因子的选择
各式各样的“鸡尾酒”
OCT4+SOX2+KLF4+cMYC (2007 Cell) OCT4+SOX2+NANOG+LIN28 (2007 Science) OCT4+SOX2+cMYC (2008 NBT) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+SV40LT+TERT (2008 Nature) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+NANOG+LIN28 (2008 Cell research) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+NANOG+LIN28+SV40LT (2009 Science) OCT4 (2009，2010) 现在，这些转录因子的小分之替代物已经相继被报道出来。 无需转录因子，仅依靠miRNA也可也实现重编程（2011 Cell Stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 细胞复苏率低 是正常的，所以冻存的时候尽可能多冻一些。 我们现在采用冻存Matrigel上的克隆，复苏 时成活率一般可达50%左右，与Y27632联合使用会 提高复苏成活率。 但是前提是冻存时细胞状态要好。建议专门冻 存细胞，不要冻实验剩下的。
多能干细胞
Oct4 Sox2 Klf4 cMyc
Yamanaka S 2007 体细胞
Oct4 Sox2 Nanog Lin28 Yu JY & Thomson JA 2007
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背景介绍： 人诱导性多能干细胞技术的前景
人诱导性多能干细胞的应用： 1. 疾病模型，研究疾病发生，搭建 筛药平台。 2. 细胞治疗 “用你的细胞定做器官” （Konrad Hochedlinger，《环球科学》 2010）
• 培养方法的改进 低氧 5% O2（2009 Cell stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的建立-技术流程
• 流程图
Cell Stem Cell,2009
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人诱导性多能干细胞的建立-克隆挑取
神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 内皮干细胞 „„
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背景介绍： 细胞核的全能性-体细胞重编程研究
核移植 技术 细胞融 合技术 直接导入外源多 能性因子的重编 程技术
Shinya Yamanaka 2006,2007
Sir John Bertrand Gurdon 1962
Masa Tada 2001
带有多能性选择标记的 小鼠（Fbx-,Oct4-, Nanog- geo) Oct4Oct4 Sox2 Myc Klf4
病毒感染/抗性选择
胚胎材料，伦理问题
带有选择标记的成体细胞
iPSCs
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GIBH.CAS
背景介绍： 人诱导性多能干细胞技术的诞生
46XX
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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人诱导性多能干细胞鉴定
-拟胚体畸胎瘤形成实验验证分化潜能
iPS EB Day5
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人诱导性多能干细胞鉴定
- 基因芯片显示与胚胎干细胞的相似程度
iPS-1
iPS-2
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
可挑克隆-有光滑边缘，胚胎干细胞样
一次性玻璃巴氏吸管， 需制备圆口（切割， 剥离）和断口（吸取） 两种
处理好 的巴氏 吸管
口吸管
灭菌枪头
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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人诱导性多能干细胞的建立 -克隆的扩大培养
• 开始一到两代的时候建议使用机械法传代。若是 克隆均一性不好，需要挑取形态好的亚克隆继续 传代。 • 克隆数量较多，均一性好，且都具有良好的形态 时可以用酶法（dispase /Collagenase IV）开始 传代，扩大培养。
人诱导性多能干细胞的建立、鉴 定与维持
华南干细胞与再生医学研究所 中国科学院广州生物医药与健康研究院 讲解：陈燊（chen_shen@) 2011-8-24
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GIBH.CAS
概
要
• 第一部分 人诱导性多能干细胞的建立 • 第二部分 人诱导性多能干细胞的鉴定 • 第三部分 人诱导性多能干细胞的维持 • 第四部分 开放性讨论
中国科学院 广州生物医药与健康研究院 GIBH.CAS
人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 无饲养层培养还是有饲养层培养？ Matrigel/ECM与mTeSR1联合使用可以支持人胚 胎干细胞的生长，可以支持人诱导性多能干细胞。 成分清楚，批次间差异小，操作方便，但是成本 较高。 饲养层培养方式是较传统的方式，成本较无饲 养层方式低廉，但需要制备优质的饲养层细胞。 • bFGF用量 4ng/ml-100ng/ml都有人在使用，主要 由不同生产者的bFGF 对细胞的支持效果决定，需 要自己摸索。
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
GIBH.CAS
人诱导性多能干细胞的建立 -诱导体系的选择
• 传统的胚胎干细胞培养条件能够支持体细胞完 成重编程，成为诱导性多能干细胞，但是效率 低。 • 一些小分子化合物的加入可以加速重编程过程， 并且可以提高重编程的效率。
VPA（2008 NBT） Vc（2009 Cell Stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 细胞团还是单细胞
越来越多的文献在报道将人胚胎干细胞制备成 单细胞进行传代，与ROCK inhibitor(Y27632)使 用是可以的，但是这种情况一般适用于均一无分 化的克隆传代。单细胞传代时需要较高的接种密 度。通常我们接种10,000cells/cm2. • ROCK inhibitor(Y27632) 工作浓度为10uM，可以促进细胞贴壁。接种时 使用，直接加到培养集中。看到两三个细胞成团 时可以撤掉。
-qPCR检测内源多能性基因与转基因表达水平
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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人诱导性多能干细胞鉴定 -多能性标志物的检测
TRA-1-81
SSEA4
TRA-1-60
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人诱导性多能干细胞鉴定 -甲基化水平检测与核型鉴定
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人诱导性多能干细胞鉴定
• • • • • • • • • 形态鉴别与AP染色 Realtime PCR 检测多能性基因的表达水平。 免疫荧光鉴定胚胎标志物的表达 多能性基因（Nanog, Oct4）启动子甲基化水平比较 基因芯片鉴定诱导性多能干细胞与胚胎干细胞在基因表达 谱上的相似程度 核型鉴定 拟胚体实验验证分化潜能 畸胎瘤实验验证分化潜能 定向分化实验验证与应用（可选）
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人诱导性多能干细胞的建立 -体细胞的选择
• 方便取材，易获得 • 没有感染传染病，例如HIV,HBV等 • 传代代数较早
但是，值得注意的是不同体细胞来源的诱导性多能干细胞可 能存在分化潜能的差异，研究证实了表观遗传学的“记忆” 存在。这些“记忆”可能会使这种诱导性多能干细胞更容 易分化成它来源的那一类型的细胞。
成纤维细胞（2007） 角化细胞（2008） 羊水细胞（2009）神经前体细胞（2009） 脂肪干细胞（2009）
2008 NBT 2009 HMG
2007 Cell
Peripheral blood cells isolated from blood (2010)
Urine Kidney (2011)
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人诱导性多能干细胞的建立 -多能性因子的选择
• 根据不同实验室的条件 • 根据不同细胞的需要 • 根据不同实验的需要
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人诱导性多能干细胞的建立 -导入系统的选择
非整合的病毒导入系统（2009 Nature, 2009 Cell） 基于转座子(piggyBac)的质粒导入系统（2009 Nature） 基于随体的质粒（episomal plasmid）导入系统 (2009 Nature) 直接用重组蛋白建立诱导性多能干细胞（2009 Cell） 直接导入多能性因子的mRNA（2010 BBRC, 2010, Cell Stem Cell）
优势：不使用胚胎来源材料，规避 伦理问题。 自体移植没有免疫排斥效应。
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构建人诱导性干细胞的要领
• • • • 用什么细胞？ 用什么因子组合？ 用什么导入手段？ 需不需要特殊的添加剂？
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人诱导性多能干细胞的建立 -体细胞的选择
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第一部分 人诱导性多能干细胞的建立
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背景介绍：人胚胎干细胞
• 胚胎干细胞（ES细胞）来源 于哺乳动物胚胎发育早期的 胚泡（Blastocyst）期的内 细胞团（ICM），是最原始 的干细胞，位于个体发育的 顶端，具有发育的全能性， 能够分化为组成机体的所有 细胞类型，并具发育成完整 个体的能力。