关于诱导性多能干细胞

诱导性多能干细胞

【关键词】干细胞; 细胞分化; 转录因子

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES）细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。iPS细胞的研究受到人们广泛的关注, 是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。iPS细胞技术诞生还不到2年, 却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望, iPS细胞技术的出现使人们从ES细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是, 目前制备iPS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题, 因此探索一种高效、安全的iPS细胞的制备方法显得十分必要。

1 iPS细胞的制备方法

2006年T akahashi等［1］研究小组利用分别携带Oct4、Sox2、Myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs), 经过G418药物筛选成功获得第1批iPS细胞。但是这批iPS细胞系中DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞不同, 而且这批iPS细胞不能形成畸胎瘤。Okita等［2］研究小组报道了第2批iPS细胞的产生。他们采用与制备首批iPS细胞相同的方法, 但是采用了不同的筛选基因。第2批iPS细胞系DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞的甲基化方式相同, 并且能形成畸胎瘤。2007年末, Takahashi和Yu等［3, 4］两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于iPS研究里程碑的实验结果, 他们都成功获得了人的iPS细胞系。Yamanaka 采用与诱导小鼠iPS相同的方法, 成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。Thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法, 他们利用慢病毒载体运输Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子转染IMR90胚胎成纤维细胞, 并且成功地获得了人iPS细胞。2008年1月Nakagawa等［5］研究小组报道他们可以利用Oct4、Sox2和Klf4 3种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出iPS细胞。Aoi等［6］研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为iPS。Stadtfeld等［7］实验小组利用Oct4、Sox2、c myc和Klf4 4种转录因子将胰岛细胞诱导为iPS细胞。

Hanna等［8］研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成iPS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备iPS细胞的方法, 使用4种转录因子（Oct4、Sox2、c Myc和Klf4）及CCATT/增强子结合蛋白（C/EBPα）, 成功地将成熟B淋巴细胞诱导为iPS细胞。

Eminli等［9］研究小组利用逆转录病毒载体携带Oct4、Klf4和c Myc 3个转录因子将神经祖细胞诱导为iPS细胞, 之后Kim等［10］研究小组报道利用慢病毒载体携带Oct4和c Myc或Oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为iPS细胞。他们

检测到在成人神经干细胞中Oct4和c Myc的表达量高于胚胎干细胞中Oct4和c Myc的表达量, 因此考虑利用逆转录病毒载体只携带两种转录因子诱导成人神经干细胞为iPS细

胞并获得成功。由此他们推测当被诱导的体细胞中高表达某个或某几个转录因子时, 可以减少其他转录因子的使用。

当一系列人正常体细胞被诱导成iPS细胞之后, 科学研究者开始研究患者的细胞是否

也能诱导成iPS细胞。Dimos等［11］研究小组报道他们将肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）患者的细胞成功诱导成为iPS细胞。随后Park等［12］报道他们将腺苷脱氨酶缺陷相关严重的联合免疫缺陷、三型葡萄糖脑苷脂沉积症、帕金森综合征、舞蹈症、青少年I型糖尿病等患者的细胞诱导为iPS细胞。

体细胞可以诱导为iPS细胞, 但是获得iPS细胞的几率很低。于是科学研究者们研究能否找到提高iPS细胞产生效率的方法。Mali等［13］报道他们将SV40大T抗原和Oct4、Sox2、c Myc和Klf4同时诱导成纤维细胞能显著提高iPS细胞产生的效率, 而且iPS细胞提前1～2周产生。Huangfu等［14］报道DNA甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能显著提高iPS细胞产生的效率。Aasen等［15］研究小组报道采用逆转录病毒运输Oct4、Sox、Klf4和c myc诱导人角化细胞产生iPS细胞的效率比诱导人成纤维细胞产生iPS细胞的效率至少提高100倍, 而且大大缩短了产生iPS细胞的时间。

Maherali等［16］研究小组报道了制备iPS细胞新的研究平台, 并指出可从分子、遗传和生化机制上改造细胞程序重排技术。他们开发了一种新的iPS细胞诱导技术, 采用doxycycline诱导转录因子的表达, 从而可以通过药物来控制iPS细胞的产生, 其制备的iPS 细胞从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。人们研究发现, 不同的皮肤细胞类型用于诱导产生iPS细胞的时间也不同［16］。Huangfu等［17］研究小组报道仅利用反转录病毒表达Oct4和Sox2两种转录因子, 同时借助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小分子化合物 丙戊酸（Valproic Acid, VPA）的作用就能将人的成纤维细胞系BJ和NHDF逆转成iPS细胞。

最近, Stadtfeld等［18］报道他们利用腺病毒载体运输Oct4、Sox2、Klf4和c Myc 4种转录因子成功获得无病毒整合的iPS(Adeno iPS)细胞。Okita等［19］研究小组采用2种质粒分别携带Oct4、Sox2和Klf4 3种转录因子和c myc转录因子共转染人或小鼠的体细胞并使之诱导成为iPS细胞, 经过检测并无质粒整合进入iPS细胞基因组中, 即获得了在基因组水平无转录因子整合的iPS细胞。Frank 等采用带有loxp Cre 系统的病毒载体诱导iPS, 此系统可将整合到iPS基因组中的4种外源转录因子及病毒基因成分完全剔除, 因而所获得了完全没有病毒基因组的来源于Parkinson患者成纤维细胞的iPS; 而Knut 等人使用含有转座子系统的病毒载体也成功获得了完全没有病毒基因组的来源于人胚胎成纤维细胞的iPS。这些无病毒基因组成分的iPS诱导成功为其临床实际应用奠定了基础。iPS细胞产生的方法归纳见表1。表1 诱导iPS产生的方法

小鼠胚胎成纤维细胞［13］Oct4, Sox2, Klf4小鼠及人成纤维细胞［5］Oct4, Klf4, c myc神经祖细胞［9］Oct4, Klf4成人神经干细胞［10］Oct4, c myc成人神经干细胞［10］Oct4, Sox2, c myc, Klf4, Nanog人角质细胞［16］Oct4, Sox2人成纤维