基因治疗综述

基因工程综述

基因治疗研究进展及基因载体介绍

摘要：基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。基因治疗的基本组成元件是：载体(病毒载体、非病毒载体)、转导基因(外源基因)和靶基因。本文主要综述基因治疗的载体研究进展和基因治疗的疾病研究进展、存在的问题和发展前景。

关键词：基因治疗病毒载体非病毒载体发展前景

基因治疗(gene therapy，GT)最早指在原位用正常基因替换缺陷基因来治疗人类疾病，后来指将外源基因导入细胞以纠正基因缺陷，其概念随分子遗传学技术的不断发展而拓展，目前指将外源基因转移至患者细胞内并有效地适度表达，以达到治疗疾病的目的。基因治疗可以是直接修复、补偿缺陷基因。或抑制某些基因的过度表达；也可间接增强机体免疫功能。或利用外源基因对病变细胞特异性杀伤等。[1]

一、基因治疗中载体研究进展

基因治疗这项生物医学技术要求将目的基因运输到靶细胞，进而将目的基因运输到细胞核部位。因此，基因治疗的关键技术是基因传递载体的设计。基因治疗中常用的载体有病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等；非病毒载体主要是纳米载体和高分子载体。

1、病毒载体

1.1 腺病毒载体

腺病毒载体是目前临床基因治疗中使用最多的载体，占所有使用的基因治疗载体24％。腺病毒载体在基因治疗中的优点有：首先，给人方便。可以多种途径给入，如肌注、静注、口服和雾化吸人。其次，安全性好。经临床及实验研究证实，常用的5型腺病毒无致病及致癌作用，不会引起癌基因激活。再次，宿主范围广。动物实验表明，给予机体腺病毒后，可分别在肝脏、肺脏、心肌及骨髓肌发现感染并可表达所载的目的基因，另外局部注射如肌肉、大脑及视网膜后等部位，也可使之感染并表达。[2]

然而，它缺乏特异靶向性，在一些缺乏其相应受体的细胞中感染效率低。现在很多实验室在构建靶向腺病毒载体，它们主要针对腺病毒天然噬性进行改造，从而只对特异性受体具有靶向性[2]。在体内应用时产生的免疫反应也限制了它的应用，空壳载体删除了病毒基因组，只保留了ITRs及包装信号，也称为裸腺病毒载体，是第3代腺病毒载体。它去除了所有病毒编码基因，仅保留了5 7和3’末端反向重复序列与野生型腺病毒的包装信号。需要辅助病毒提供编码序列。空壳载体可以容纳多达36 kb的外源DNA，可以携带大量cDNA与适宜的调控元件，比起第1代和第2代载体，空壳载体表现出低免疫原性和体内表达的持久性。。因此，以第三代腺病毒为载体在进行基因治疗中具有重要意义。[3]

1.2逆转录载体

反转录病毒(Retrovirus)是一类已知的RNA病毒。该载体系统有两部分组成，一是带有外源基因的重组反转录病毒载体分子。二是能以反式提供病毒结构蛋白

的包装细胞，其要求是能高效产生感染靶细胞的霞组病毒颗粒。且无野生型的反转录病毒存在，后者是基因治疗安全性的关键问题。逆转录病毒载体最大优点是：(1)转染谱广，可以感染各种细胞类型；(2)转入的外源基因可完全整合；(3)对细胞感染率高，达到100％；(4)感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。根据报道利用逆转录病毒作为载体来进行血友病A的基因治疗已经有了很大的进展。[4]

其中，γ逆转录病毒载体(一般由小鼠白血病病毒MLV改造而来)是最早被改造的且最广泛地被应用到基因治疗当中。1990年，Blaese等用γ逆转录病毒载体来表达腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)基因，该载体被命名为LASN，用于治疗两例重症联合免疫缺陷(ADA severe combined immunode—ficiency，ADA —SCID)的儿童患者。但存在着一些不足：不能感染非分裂细胞；转录终止能力相对较弱；从有可能造成转录通读；可能产生有复制能力的病毒；可能造成插入性突变；包装外源基因的能力有限(一般在7 kb以下)等。[5]

慢病毒是属于逆转录病毒的成员之一，它的特点是可以感染分裂期和静止期细胞。而且与其他载体相比．慢病毒载体的免疫原性比较低。同样，它也可以整合基因至宿主细胞中使其长期稳定表达。因此，慢病毒在基因治疗中具有良好的应用前。

1.3其他病毒载体

除上述常用的病毒载体外，应用于基因治疗的载体还包括腺相关病毒，单纯疱疹病毒，痘病毒和溶瘤病毒。其中腺相关病毒最常用于眼部疾病的基因治疗，如遗传性视网膜退行性病变。腺相关病毒(AAV)载体作为基因转移载体具有安全性好、宿主范围广、转染和表达效率高、目的基因长期表达等优势，是视网膜色素变性基因治疗领域最具潜力和应用价值的病毒载体[6]。

2、非病毒载体

非病毒载体具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高、外源基因长度不受限制等优点。最简单的非病毒基因转移系统是裸DNA，可直接注入特定的组织，特别是肌肉，造成较高水平的基因表达。目前，正在研究的非病毒载体还有聚合物(聚-L一赖氨酸、聚乙烯亚胺等)、复合载体以及纳米粒子载体等。2.1纳米生物技术基因治疗载体

2.1.1纳米基因载体的优点

纳米基因载体的优点：：(1)纳米脂质体主要由群脂以及胆围醇合成，这两种化学物质本身就是细胞膜的主要成分，由于它们仿生物膜的特点，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导人靶细胞；(2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；(3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；(4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基囡的摄取。[7]

2.1.2 纳米基因载体类型

纳米基因载体主要有一下几类：

（1）纳米脂质体，是由脂质体构建的囊泡/囊膜载体，根据载体自身所带电荷分为阳离子脂质体、中性脂质体和阴离子脂质体。阳离子脂质体是非病毒载体中研究和应用最多的载体之一。[8]