第四章体外配体结合分析

摇均匀后，放置待其竞争结合反应达平衡后
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测总射线（可以测2-3管求均值）
去除上清液测B；也可求出F 画出标准曲线
从标准曲线查出待测品的Ag含量
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1. 配制一系列已知浓度的标准抗 原Ag的反应管，并标明浓度；
2.分别向反应管中加入固定量的 *Ag、Ab；
3.经过一定时间的温育竞争结合 反应；
4.待竞争结合反应平衡后，分 离结合B（Bond）部分和游 离F(来自百度文库ree)部分；
5.用放射性探测器测得*Ag-Ab 放射性为B或游离*Ag的放射 性为F；
6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]，
或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag 为“0”，故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率；
特点：
1 属于非竞争性抗原、抗体结合反应 2 抗原-抗体复合物的量与所加非标记抗
原的量呈正相关 3 在低剂量区不会有不确定因素 4 免疫放射分析法的非特异结合对低剂
量区结合影响大，对分离条件的要求 非常严格
二、基本方法
（一）双抗体夹心法 （二）标记第三抗体法 （三）其他方法
三、RIA与IRMA的比较
放射免疫分析
一、原理 Ag+Ab + *Ag
AgAb+Ag
*Ag+*AgAb
二、必备条件
（一）抗体(结合剂）：高亲和力、高特异性、高滴度 （二）标记抗原
125I,放化纯，长半衰期，标记后不改变抗原活性。 （三）标准品
与被测物为同一物质，定量精确，放化纯高 （四）B与F 分离技术 （五）放射性测量仪
7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原 浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0 随Ag量变化的曲线即为标准曲线。
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8.在相同条件下，测得被测样 品Ag的B%或样品/B0%的浓 度与标准曲线对照，即可查出 被测样品Ag的浓度。
三、分离方法
（一）液相分离技术
1.双抗体沉淀法 2.聚乙二醇法(PEG) 3.葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法 4.活性炭吸附法
RIA
IRMA
标记物 原理 抗体量 标准曲线 达到平衡的速度 可测范围 应用对象
抗原 竞争性结合 限量 负相关 慢 窄 大分子、小分子
抗体 非竞争性 结合 过量 正相关 快 宽
大分子
非放射性标记免疫技术
一、酶标记免疫分析技术
酶联免疫吸附分析法（ELISA）
二、化学发光分析法 化学发应释放自由能，激发态， 退击释放光子
实验操作步骤
1 2 3 4 5 6 789
Ag 0ng/ml 5ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 40ng/ml 80ng/ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
1 23 4 5 6 7 8
Ag *Ag
0ng/ml 5ng/ml 10ng/m 20ng/ml 40ng/ml 80ng/ml 待测1
（二）固相分离技术
四、实验操作步骤 加样、温育、分离、测定
放射性、数据处理
五、实验分析性能（稳定性）
（一）精密度 （二）灵敏度 （三）准确度
六、质量控制
免疫放射分析法
一、基本原理
1968年由Miles和Hales建立免役放射分析法（IRMA） 原理:125I标记抗体做示踪剂与非标记抗原(待测样品 或标准品)形成复合物,除去多余的游离抗体,测量复合 物的放射性。
第四章 体外配体结合分析
概述
20世纪60年代,Berson和yalow,放射免疫分析(RIA),诺贝尔奖. 20世纪70年代,Engvall和Wecman,酶标记免疫分析(EIA) 80年代时间分辨荧光免役分析(TRFIA) 化学发光免役分析(CLIA) 电化学发光免役分析(ECLIA) 微粒体发光免役分析(MLEIA)
0.1ml 0.1ml l
0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
0.1ml
0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
Ab 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
待测2 0.1ml
0.1ml
0.1ml
分离试剂 2ml
三、时间荧光免疫分析 四、RIA 与非放射性标记免疫分析法的比较
体外标记免疫分析的临床应用
一、蛋白质和肽类激素 二、病原体抗原 三、肿瘤标记物