微生物鉴鉴定系统-质谱法

70 60
8823.5
Fingerprint
50
5897.8 6271.2
12271.4
8054.3 8383.8 8610.6 8903.3 9075.2 9611.5 10110.8 10493.9 10975.2
6533.3 6629.0
6786.7 6984.6 7209.8
7424.9
40
单核增生性李斯特菌Listeria monocytogenes (Lm) 兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯 特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力
对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是 20-30%
该菌经常存在于速食食品中
Ex. About 2,500cases/year in USA
4353.0 4543.1 4700.9
5014.6 5266.4 5209.0
4433.7
4973.7 5237.0
5676.0
5735.6
6045.0 6306.0 6345.8
6714.7 6674.2
6320.2 6618.3 6692.2
7201.0 7487.8
7763.4
7097.7 7575.0
No major qualitative changes in peak patterns distinguishing family, genus and species
Decrease of signal intensity over time
Presence and absence of peaks
Identification with >99% confidence
SARAMIS 工作流程
样品
LIMS
鉴定/ 比较分析
转移细胞到 MALDI 靶板
基质
导入数据至 SARAMIS
5263
4086 4982 4478
4000
6009
6260 6000
9638
7774
8176
9970
7545 7453
SARAMIS – 比较工具
5263
4086 4817 3142 3771 4469
6009 6746 5709 6260 6788
7774
8176 8792
7545 8339 8962 7888
9638
9970 10219
3000
4000
5000
6000
7000
8000 m/z
9000
10000
8962
10165
8000 m/z
10000
11422 12528
12000
1[c].2I4
微生物鉴定流程
生长在固体 培养基上的菌落
找到匹配度最可信的谱图
全细胞 MALDI-TOF谱图
数据库中参考谱图
输出可信鉴定结果
日期
MS 数据
样品名称
鉴定结果界面
鉴定结果 置信度
不同颜色代表不同置信水平
深绿: 99.9% 浅绿: 90-99.9% 黄色: 85-90% 白色: 70-85% 低于70%不显示置信值
100
80
60
40
20
0
10000
20000
+ve mode [M+H]+ ions
30000 40000 m/z
MALDI基质辅助激光解析附原理:
Streptococcus pneumoniae:
8806
9071 S18 9357 L31
9517
7985 L29
8394
6638
6865 L32
58 72
• 使用者可以做聚类分析，创建系统树图用于菌株分型
3-Aug-20
18
SARAMIS 菌种特异峰型
• 合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰 (如：在 各谱图中出现 70% 的)
• 在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权 重值
• 具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定 • 具有菌种特异性的峰值权重则会加重
~50% of peaks unambiguously represent ribosomal proteins
protein masses obtained from the Swiss-Prot/TrEMBL sequence database
微生物鉴定方法
感官
视觉, 嗅觉, 味觉
气质法（GC-MS）
5263 L34
12310 L7/L12
10089 L27 10403 S15 10618 S19 10783 L23 11019 S6 11451 S10
7 286
7703 L35
8061
6265 L30
6505
6750 L28
4419 L36
4 757
% Intensity
5 951
5651 L33
Pseudomonas aeruginosa and Achromobacter xylosoxidans
Shows peaks specific to both species
4331.8 7291.6
食品安全
Tokyo Marine University, Prof Kimura and Dr. Takahashi
自然界菌种多样性
在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图 谱，基因组学，表型数据）
frequency frequency
phylogenetic distance
phylogenetic distance
atypical reference isolates are over-represented in SARAMIS
• MALDITOF/TOF
• PSD & CID capability
Resonance
• Unique instrument • MALDI-ion trap-TOF • reflectron only • MSn capability • High resolution and
high mass accuracy
7337 6604 7291
3 000
5 000
70 00
m/z
9 000
11000
1 300 0
mass signals matching to ribosomal proteins (considering possible
methionine cleavage and/or methylation) are marked in red
SARAMIS与LIMS系统
1.
%Int. 100
80 60 40 20
0
1713 mV[sum= 42832 mV] Prof iles 1-25 Smooth Av 30 4363 6289 7243
5393
7647
5264
6382 7271
9140 9482
3620 4567 4000
5676
脂肪酸，小分子糖
分子
PCR……
耗时
免疫
单或多克隆抗体
MALDI-TOF MS
生化
代谢能力和耐抗生素
微生物鉴定新方法（MALDI TOF）
• 比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体 • 分析时间仅1-2 minutes
3-Aug-20
6
现代微生物分类学:蛋白组学 & 基因组学
Protein
Bacterial Cell
8
8
肠杆菌 （Enterobacteriaceae）MS图谱示: 科, 属, 种特异性峰值
Escherichia coli Hafnia alvei
部分峰值是多数菌种共有的 （如 m/z 4365: 核糖体蛋白 L36)
Leclercia adecarboxylata Klebsiella pneumoniae
峰值有 科, 属, 种或 亚种特异性
3000
5000
Enterobacter aerogenes Proteus mirabilis
种间特异性代表峰值用来区 分不同菌种
7000 m/z 9000
11000
13000
9
9
核糖体蛋白不受生长条件影响
Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 at different incubation times
AXIMA – iDPlus: 质谱法快速鉴定微生物
MALDI TOF产品系列
Assurance
• Linear only • MALDI-TOF
Confidence
• Linear and reflectron
• MALDI-TOF • PSD capability
Performance
• Linear and reflectron
7319.6
8403.9
8584.6 8745.8 8880.7
8562.0
9215.8
9086.0
9427.9
9588.6 9724.2
9402.7
9959.9 10029.9
10123.2
10534.6
11401.7
12565.8
SARAMIS鉴定混合菌种
A mass spectrum of a mixed sample containing
DNA
Proteome
Species Definition & Determination
% I nt ensi t y
V
o
y
a
g
e
r
S
p
e
c
#
1
=
>
A
d
v
B
C
(
3
2
,
0
.
5
,
1
.
0
)
=
>
N
F
0
.
7
[
B
P
=
4
4
2
3
.
9
,
2
1
1
7
]
100
4424.2
9476.2
Mass
2117. 3
90
4861.0
80
红色: 提醒复杂的结果
科 属
型 种
匹配2种或以上菌种，置信度>99% :
鉴定混合菌
数据数量
只需数秒，全自动添加新采集数据至鉴定结果界面！
8000 Mass/Charge
13000
12000
11000
10000
9000
7000
6000
5000
4000
3000
3161.1 3344.5
3645.0 3787.2
6137.3
ห้องสมุดไป่ตู้
4026.9 4535.6 4765.4 4738.6
30
3132.3 3311.8 3491.4
20
10
0
3000
5000
7000
9000
11000
13000
Mass (m/ z)
MALDI-TOF MS
DNA Fingerprint
Genome
不同细菌代表性指纹图谱不同
Pantoea agglomerans
菌种鉴定准确度
Classified as genus => species => strain “Thickness” of database is important.
From 2011 European society of clinical microbiology and infections disease
MALDI-TOF MALDI: 线性工作原理
Sample target
Laser
Time of flight (TOF) mass analyzer (field free)
Linear detector
Ion optics
1. Mix matrix & sample on target 2. Fire laser at matrix/sample 3. Ionize sample (solid to gas phase) 4. Accelerate / extract ions 5. Separate ions in analyzer 6. Record spectrum at detector
SARAMIS：Spectral ARchive And Microbial Identification System
• 数据库含有超级谱图（ SuperSpectra ）和参考谱图（ Reference Spectra ）
• 使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图
• 软件包可实现谱图的存储，分析和比较
Eatable without heated and cocked or cocked food, ex., ham, daily product, salad, smoked food etc
•现有检测方法需要2步骤和选择培养基，耗时6天
Yakult (养乐多)
乳酸菌生产质量控制 品种改良 Performance + SARAMIS
11000
12000 13000
Cluster analysis of selected reference and sample mass spectra
Comparison to mass spectral patterns of reference spectra in the database
Acinetobacter lwoffi
4000
m/z
8000
Burkholderia cepacia
Raoultella ornithinolytica
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
4000
m/z
8000
各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！