微生物的分子鉴定

微生物的鉴定流程1

2传统微生物鉴定简述3分子生物学鉴定

1.微生物的鉴定流程

流程：

传统分类鉴定法现代分类鉴定法

2. 传统微生物鉴定简述鉴定指标:

（1）菌落形态

（2）菌体形态

细菌：

真菌：

（3）理化特征

淀粉水解实验代谢产物特征

（4）不足

传统的鉴定的主要依据是形态特征、理化特征、生态特征和血清学特征，需要进行微生物的培养及一系列生化反应或免疫学检测。其缺点是检测项目多、工作量大、复杂耗时、结果不稳定，易出现弱反应或假阳性，存在明显的不足。分子生物学操作简单，鉴定快速，且准确性高，现常用于菌种的鉴定。

3. 分子生物学鉴定

16SrDNA鉴定法：利用了PCR的方法，根据16s rDNA两端的保守序列，设计引物PCR扩增未知细菌的16s rRNA基因，然后对PCR扩增的DNA片段进行序列分析，经与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，对未知菌种进行鉴定。该方法是在分子水平上对细菌进行的分类，具有快速、准确、重复性好等优点。

（1）具体流程：

基因组的制备

PCR 扩增 16sRNA

PCR产物纯化

阳性克隆鉴定，测序

同源性分析，系统进化树建立

（2）鉴定的原理

细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占总量的80%以上，其分子量大，种类多，由高度保守区和可变区组成。细菌的rRNA包括5S、16S、23S，其中5S rRNA信息量少，不适合分析；23S rRNA分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适于细菌鉴定；相比之下16S rRNA的遗传较为稳定，长度在1550±200bp左右,代表信息量适中，是研究系统进化的好材料。目前已报道了15000种以上的细菌16S rDNA序列，通过对16S rDNA序列分析，可以将细菌划分到属或种，对于难以培养的细菌、生化反应不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌，使用该法鉴定细菌尤为方便。

（3）鉴定的步骤

①基因组DNA的制备

从琼脂平板上挑出10个单菌落或从三角瓶中取200 μl菌液，采用细菌少量提取基因组DNA试剂盒提取各个样品的基因组DNA，4℃保存备做模板。

②引物（ Primer ）设计

一般根据同属菌种的基因序列用Primer Premier设计引物，设计后合成用于PCR进行特征序列的扩增。如果是未知菌株常用通用引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1495r：5′- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

（3）鉴定的步骤

③ PCR扩增

按下述组分配制PCR反应体系

模板*： 1μl

PCR Premix 25 μl

Forward Primer 0.5 μl

Reverse Primer 0.5 μl

16S-free H2O up to 50μl

④ PCR反应条件如下：

94℃ 5min

94℃ 1min

50℃ 1min 30cycles

72℃ 1.5min

72℃ 5min

（3）鉴定的步骤

⑤ 琼脂糖凝胶电泳检测

使用1%的琼脂糖进行电泳，结果如下。电泳结果显示，目标菌株扩增出了16SrDNA的DNA条带，产物长约1700 bp 。

15001470

（3）鉴定的步骤

⑥ 目标产物纯化、克隆、测序

目标产物割胶纯化目的片段，进行克隆，筛选阳性克隆然后进行测序（有条件可以自己测序，也可以送到测序公司进行测

序）；或者目标产物片段回收后不进行克隆，直接进行测序。

（3）鉴定的步骤

⑦ 结果比对分析

将细菌16SrDNA的测序结果通过GenBank（NCBI）进行了比对，根据同源性的对比鉴定了相应的细菌。

T3 菌株和相关菌株 16S rDNA 基因的系统发育树

16SrDNA进行细菌鉴定的不足：有的菌种由于种间差异小，单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种。若是要鉴定到种，可以结合部分生化试验加以补充。

此外，对于真菌的分子鉴定，也可以参照16SrDNA鉴定法，不过真菌扩增的基因片段为18SrDNA，流程和

16SrDNA鉴定法相似。

思考题：

l1.请问传统菌种鉴定方法一般测定哪些指标？存在哪些不足之处？

l2.请简要描述16SrDNA鉴定菌种的流程。