基因的克隆、表达载体构建及功能验证Word版

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）

一、基因克隆

★事前三问

a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？

b.这个基因在哪种材料中扩增？

c.材料需要怎么处理？

◎ 实验前准备工作

a.设计引物，准备材料，

b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试

剂盒

c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备

※ 基本流程

提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—

涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序

1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成

1.1叶片、根总RNA的提取

Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。

1）实验前准备

预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。

2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：

（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。

（6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

（7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。

（9）配制以下体系：

10×DNase buffer 5 μl

DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl

RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl

Total RNA 70 μg

加去RNase水至总体积为50 μl

（10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。（12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3） RNA的质量及纯度检测

（1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。

（2）分光光度计RNA纯度检测

取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。

4） cDNA第一条链的合成

按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：

1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

试剂名称使用量

模板RNA 1 µg

Oligo dT primer (50 µM) 1 µl

dNTP Mixture(10 mM) 1 µl

RNase free dH2O up to 10 µl

2） 65 ℃保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。

3）离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。

4）在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液:

试剂名称使用量

上述模板RNA/引物等的混合液 10 µl

5×Frist-Stand Buffer 4 µl

RNase Inhibitor(40 U/ µl) 0.5 µl

MTV RTase (10 U/μl) 0.5 µl

RNase free dH2O up to 20 µl

5） 37 ℃保温60 min。

6） 95 ℃,5 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取

（1）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有：

1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml

4MNaCl 1.5 ml

10%SDS 5 ml

DEPC-H2O 41.25 ml

（2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 ℃水浴预热。

（3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。

（4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，12000rpm 4 ℃离心10 min。

（5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4℃离心10 min。

（6）取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 ℃保存过夜。

（7）离心10 min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。

（8）加入9 ul DNA酶(无RNA酶)，10 ul 10×buffer（DNA酶所带）和1 ulRasin（Rnas 抑制剂），37 ℃ 30分钟（再加500 ul水）

（9）取出用 300 ul氯仿和 300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm 4 ℃离心10 min。

（10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 ℃离心10 min。

（11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇， -80 ℃冰箱过夜；

（10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80℃，备用。

2.2.2.1 cDNA第一条链的合成

（1）基因组DNA的去除反应

试剂使用量

5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ul

gDNA Eraser 1.0 ul