实验酶切胶回收和连接
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? 原理：
DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA，通过DNA 连接酶催化两双链DNA片段组邻的5'端磷酸与3'端羟基之 间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。本实验利用T4DNA连 接酶，有Mg2+,ATP存在的连接体系中，将载体pUC18与目的 基因连接起来。
连接体系
?
DNA ： 7ml
操作步骤
1. 取一干净的1.5ml的离心管，称重，标记。
2. 紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段的DNA凝胶，放入 已称重的离心管中，称重。
3. 按每100mg琼脂糖凝胶加入400ml binding solution的量添加 solution至装有凝胶的离心管中。50~60℃放5~10min融胶。
限制性内切核酸酶消化DNA、从琼脂 糖凝胶中回收DNA及载体与目的基因 的连接
实验目的
? 掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法 ? 掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法 ? 掌握如何构建体外重组DNA分子及DNA的连接方法
限制性内切核酸酶消化DNA
? 限制性内切核酸酶 （restriction enzyme) 是一
类识别DNA上特意核苷酸序列并产生切割反应的内切 核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶 作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究 中不可缺少的酶之一。
原
理
? 限制性内切酶 能识别，结合双链DNA分子中特异的
核苷酸序列，并在该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷 酸二酯键，切断DNA双链结构。
wash solution。 8. 将Genclean柱放到一干净的1.5ml的离心管中，加入30ml
Elution buffer,37 ℃放置2min, 12000rpm,1min.所得液体即目的 片段。 9. 取5ml目的片段，加入1ml 6×loading buffer，电泳鉴定。剩余 液体可直接用于后续试验或-20 ℃保存。
琼脂糖凝胶回收：
原理：
? 不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳 动速度不一样而分离，通过回收可用于后续实验。
? NaI存在条件下，加热至55℃，含有DNA片段的琼 脂糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分 子，从而得到纯净的DNA片段。
? 硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附 DNA，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐 浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，使用弱碱溶 液如TE(pH8.0)等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的 DNA片段。
? 载 体 ： 1ml
? T4 Buffer : 1ml
? T4DNA Ligase: 0.5ml
? ddH2O : 0.5ml
总体积 ： 10ml (所需要用到得酶及缓冲液均需冰浴，以防蛋白变性 )
注意事项
? 电泳所用的胶的浓度为1%，胶经冻融后，孔径较大， 利于挤压。
? 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置 于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量 短。
? 在切胶时，要注意尽量沿目的片段的边缘切下，使其 所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提 纯。
DNA 的重组连接
使反应体系在这个温度下进行酶切。 酶切2h后加2ml
10×loading buffer终止酶切反应，取全部的样品用于胶回收。
试验中用到的两种酶的缓冲液
? HindⅢ:
EcoRⅠ:
M Buffer
H Buffer
? 对于HindⅢ来说，在含有 M Buffer 时的酶切效率最高；
? 而对于EcoRⅠ来说，在H Buffer里面的酶切效率高；
? 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸， 具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的
序列称为反向重复序列 ）特征。
? 限制性内切核酸酶消化产生的DNA末段分为5' 粘性末 端，平末端，3' 粘性末端三大类。末端的5' 端为磷酸基 团（-P)，3' 端为羟基基团(-OH)。这些末端结构可能影 响其它酶（如连接酶）的反应效率，应特别注意。
4. 将以上溶液转移至Genclean柱中，室温放置2min，6000rpm室 温离心1min。将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离 心一次。弃收集管中的废液。
5. 往上述管中加入500ml wash solution，12000rpm，1min，弃废 液。
6. 重复步骤5一次。 7. 将Genclean柱放回收集管中，12000rpm ，1min，彻底去除
? 在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分 别是HindⅢ和EcoRⅠ，这两种酶切割后产生 的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物 与载体正确的连接。
酶切体系
?
10×M : 2ml
?
HindⅢ : 1ml
?
EcoRⅠ: 1ml
?
ddH2O : 6ml
?
质 粒 ： 10ml
总体积 : 20ml
将酶切体系按顺序加好后放入已预热的37°C 的水浴锅中，
? 但在两者同时进行酶切时，在M Buffer里时的效率最高。
因此本实验中我们用M Buffer来进行HindⅢ和EcoRⅠ
的双酶切。
Baidu Nhomakorabea
从琼脂糖凝胶中回收DNA
? 在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片 段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能 会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片 段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。
DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA，通过DNA 连接酶催化两双链DNA片段组邻的5'端磷酸与3'端羟基之 间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。本实验利用T4DNA连 接酶，有Mg2+,ATP存在的连接体系中，将载体pUC18与目的 基因连接起来。
连接体系
?
DNA ： 7ml
操作步骤
1. 取一干净的1.5ml的离心管，称重，标记。
2. 紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段的DNA凝胶，放入 已称重的离心管中，称重。
3. 按每100mg琼脂糖凝胶加入400ml binding solution的量添加 solution至装有凝胶的离心管中。50~60℃放5~10min融胶。
限制性内切核酸酶消化DNA、从琼脂 糖凝胶中回收DNA及载体与目的基因 的连接
实验目的
? 掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法 ? 掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法 ? 掌握如何构建体外重组DNA分子及DNA的连接方法
限制性内切核酸酶消化DNA
? 限制性内切核酸酶 （restriction enzyme) 是一
类识别DNA上特意核苷酸序列并产生切割反应的内切 核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶 作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究 中不可缺少的酶之一。
原
理
? 限制性内切酶 能识别，结合双链DNA分子中特异的
核苷酸序列，并在该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷 酸二酯键，切断DNA双链结构。
wash solution。 8. 将Genclean柱放到一干净的1.5ml的离心管中，加入30ml
Elution buffer,37 ℃放置2min, 12000rpm,1min.所得液体即目的 片段。 9. 取5ml目的片段，加入1ml 6×loading buffer，电泳鉴定。剩余 液体可直接用于后续试验或-20 ℃保存。
琼脂糖凝胶回收：
原理：
? 不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳 动速度不一样而分离，通过回收可用于后续实验。
? NaI存在条件下，加热至55℃，含有DNA片段的琼 脂糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分 子，从而得到纯净的DNA片段。
? 硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附 DNA，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐 浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，使用弱碱溶 液如TE(pH8.0)等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的 DNA片段。
? 载 体 ： 1ml
? T4 Buffer : 1ml
? T4DNA Ligase: 0.5ml
? ddH2O : 0.5ml
总体积 ： 10ml (所需要用到得酶及缓冲液均需冰浴，以防蛋白变性 )
注意事项
? 电泳所用的胶的浓度为1%，胶经冻融后，孔径较大， 利于挤压。
? 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置 于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量 短。
? 在切胶时，要注意尽量沿目的片段的边缘切下，使其 所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提 纯。
DNA 的重组连接
使反应体系在这个温度下进行酶切。 酶切2h后加2ml
10×loading buffer终止酶切反应，取全部的样品用于胶回收。
试验中用到的两种酶的缓冲液
? HindⅢ:
EcoRⅠ:
M Buffer
H Buffer
? 对于HindⅢ来说，在含有 M Buffer 时的酶切效率最高；
? 而对于EcoRⅠ来说，在H Buffer里面的酶切效率高；
? 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸， 具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的
序列称为反向重复序列 ）特征。
? 限制性内切核酸酶消化产生的DNA末段分为5' 粘性末 端，平末端，3' 粘性末端三大类。末端的5' 端为磷酸基 团（-P)，3' 端为羟基基团(-OH)。这些末端结构可能影 响其它酶（如连接酶）的反应效率，应特别注意。
4. 将以上溶液转移至Genclean柱中，室温放置2min，6000rpm室 温离心1min。将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离 心一次。弃收集管中的废液。
5. 往上述管中加入500ml wash solution，12000rpm，1min，弃废 液。
6. 重复步骤5一次。 7. 将Genclean柱放回收集管中，12000rpm ，1min，彻底去除
? 在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分 别是HindⅢ和EcoRⅠ，这两种酶切割后产生 的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物 与载体正确的连接。
酶切体系
?
10×M : 2ml
?
HindⅢ : 1ml
?
EcoRⅠ: 1ml
?
ddH2O : 6ml
?
质 粒 ： 10ml
总体积 : 20ml
将酶切体系按顺序加好后放入已预热的37°C 的水浴锅中，
? 但在两者同时进行酶切时，在M Buffer里时的效率最高。
因此本实验中我们用M Buffer来进行HindⅢ和EcoRⅠ
的双酶切。
Baidu Nhomakorabea
从琼脂糖凝胶中回收DNA
? 在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片 段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能 会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片 段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。