透明质酸的制备及应用现状

透明质酸的制备及应用现状
摘要：透明质酸是由Myer和Palmer于1934年从牛眼的玻璃体中最先分离出此物质并加以命名的。

它是生物体内普遍存在的酸性粘多糖类物质，化学本质为(1．13-4)D．葡糖醛酸和(1．B．3)N一乙酰基-D．氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖。

透明质酸主要分布于动物的结缔组织中，但不同来源的透明质酸化学结构完全相同，仅存在相对分子量的差异，而没有种属特异性。

由于特殊的生理作用，独特的流变学特性和极强的持水保湿能力，透明质酸在化妆品工业，医学研究，临床治疗等领域有着广泛的应用。

目前，透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。

细茵发酵法生产透明质酸具有产量不受原料资源限制，成本低，产量高，有较高的相对分子量，分离纯化工艺简便，易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，应当进一步深入研究。

关键词：透明质酸；制备方法；应用
Abstract:Hyaluronic acid was first discovered through the vitreous body of the cattle eyes in 1934 by Myer and Palmer.Hyaluronic acid is comprised of linear,unbranching,polyanionic disaccharide units consisting of D-glucuronic acid and N-acetyl glueosamine joined altemately by beta 1-3 and 1-4 glycosidic bonds.Hyaluronic acid is mainly isolated from the intercellular matfix of aninal connective tissues.The chemical composition of hyalttronic acid from different sources is completely same oppositing to the molecular weigh and specific characteristics between genuses ate not existed.Because of its special physiological action,extraordinary theology character and moister-holding function,hyaluronic acid is extensively applied to areas including medical research,clinical therapy and cosmetic industry.Today,traditional hyaluronic acid producing method by extration of animal tissues has began to turn to microbial route.Because of sufficient sources.low cost,high output,relatively high molecular weigll and easy purification,hyaluronic acid by bacterial fermentation should be paid more attenfion and studied furtherly. Key words: Hyaluronic acid;
1透明质酸简介
透明质酸（Hyaluronic acid、HA）又名玻尿酸，是由N-已酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。

分子式：(C14H20NNaO11)n 结构式如图：
HA具有许多天然粘多糖共有的性质：呈白色、为无定形固体、无臭无味、具有强烈的吸湿性、溶于水、不溶于有机溶剂。

由于直链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强烈的亲水性；同时羟基的连续定向排列，又在分子链上形成高度的憎水区，HA分子的亲水和憎水特性，使得浓度低于l‰的HA也能形成连续的三维蜂窝状网络结构，水分子则在网络内通过极性键和氢键与HA分子相结合，使得这些水在柱内固定不动，不易流失， HA亲和吸附的水分约为其本身重量的1000倍，这是其它粘多糖无法比拟的。

透明质酸具有高相对分子质量和大分子体积的特性，其水溶液的比旋度为-70°—-80°，在氯化钠溶液中由于葡萄糖醛酸中的-COOH基团解离产生H+，使得HA呈现为酸性多聚阴离子状态，赋予了HA酸性粘多糖的性质。

1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。

透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。

尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为"理想的天然保湿因子"（Natural moisturizing factor，NMF)，例如：2％的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98％水分。

透明质酸是一种多功能基质，广泛分布于人体各部位。

其中皮肤也含有大量的透明质酸。

人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变
化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。

与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。

2透明质酸的制备
(一) 动物组织提取法制备透明质酸的常用原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等，主要工艺过程包括提取、除杂和分级分离。

从动物组织中提取透明质酸的一般过程如下：先将组织匀浆，再用水和稀盐溶液提取；提取用氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵沉淀；将所得的沉淀溶解除渣后，用2～3倍乙醇沉淀所得粗品。

纯化可用乙醇或季铵盐进行反复沉淀处理，或采用酶解、超滤、离子交换等技术进一步除杂质及蛋白质。

不同组织透明质酸的提取纯化过程有一定的差别。

鸡冠中脂肪成分少，透明质酸含量高，容易绞碎，经丙酮脱脂后可直接用蒸馏水反复提3次或40～50℃热提，透明质酸含量高达0.47 ％。

脐带脂肪含量较鸡冠高，可用稀碱溶液(pH8) 6O℃热提数次，或用水一氯仿溶液(20：1 ) 提取并用等体积氯仿洗涤提取液进一步脱脂，脐带透明质酸产量约为0.2 ％。

眼玻璃体透明质酸的提取多用NaCI溶液(0.1～ 1 M)，收率为0.6 4 —2.4 ％。

猪皮中含脂肪较多，且韧性很大，不易绞碎，一般用NaOH溶液37℃保温使猪皮液化后用50％的乙醇调中性，猪皮透明质酸得率为0.7 ％。

动物组织提取法是当今生产透明质酸最主要的方法，但存在浓度不高、效率低、成本高、原料来源受限制等缺点。

随着透明质酸应用范围的不断扩大，该方法已不能满足医药和化妆品生产的需求，必将逐渐被发酵法所取代。

( 二) 微生物发酵法
利用微生物发酵生成透明质酸的含量和数量主要取决于三个方面：一是菌种的筛选；二是培养基的选配及发酵工艺的优化；三是分离提纯。

生物发酵法具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等特点，是今后研究开发的方向。

1 ．菌种的筛选。

目前所用的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等『 2 J 。

为使透明质酸不被酶所分解，提高透明质酸的产量，可在发酵培养基中添加透明质酸酶抑制剂，实际生产中更常用的方法是对原始菌种进行一定的诱变处理，以得到适应性强、生命力旺盛、透明质酸产量高的安全菌株， NT G( N 一甲基一 N一硝基一 N 一亚硝基胍 ) 是较有效
的化学诱变剂。

2 ．培养基的选配及发酵工艺的优化。

目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机盐等，其中酵母浸膏最常用。

碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，还有磷酸盐、硫酸盐等无机盐。

此外，为了获得高分子量的透明质酸，培养基中不能含有促使透明质酸降解的金属离子，如铁离子、铜离子，也不能加入自由基消除剂。

透明质酸发酵有需氧发酵和厌氧发酵，有氧发酵一般产率高且分子量高。

在透明质酸发酵过程中， p H 值一般控制在6 ． 0 ～ 8 ． 5 范围内，低于6 ． 0 或高于8 ． 5 都会影响菌体生长，降低产率。

温度通常为3 7 ~ C，在不同发酵阶段采用不同的溶氧量，也可提高透明质酸的产率。

此外，发酵液黏度可直观反映出透明质酸产率的高低，透明质酸的假塑性在高剪切速率作用下使溶液黏度下降，减轻传质的影响，高搅拌速率能显著提高透明质酸的分子量，但过高的速度会降低透明质酸的分子量，通常控制在1 0 0 ～ 8 0 0 r ／ mi n 之间。

发酵液中加人少量尿嘧啶、谷氨酰胺和天冬氨酸，或加入溶菌酶，也能提高透明质酸产量。

3 ．透明质酸的分离纯化。

分离纯化的主要目的是获得纯度较高的透明质酸，目前国内外一般以葡萄糖醛酸含量表示透明质酸的纯度，保健品及化妆品中透明质酸的葡萄糖醛酸含量为 3 5 ％一
4
5 ％，药用级别为4 2 ％
～4 8 ％t 4 J 。

针对透明质酸发酵液的特性，分离纯化方法很多，在不同阶段分离纯化技术也不尽相同，但总体上可概括为如下流程：发酵液一预处理一分离( 初步纯化 ) 一纯化一干燥一成品。

( 1 ) 预处理。

预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少透明质酸分子量的降低。

常用的灭菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。

三氯乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制酶活力的作用，氯仿和三氯乙酸的作用类似。

除菌的方法也有很多，相对于盐酸法、甲醛法。

三氯乙酸除菌法对于透明质酸的产量和质量均有提高，这是由于三氯乙酸的加入使透明质酸与蛋白质的络合有一定的降解陶。

过滤除菌法是物理过程，操作简便，效果明显，并且
容易在工业化生产中应用，在发酵结束后，将发酵液加人工业乙醇得到透明质酸粗品沉淀，以2 0 g ／ L 的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以吸附菌体杂质，在p H 4 ． 6 — 4 ． 8 下过滤，滤液在p H为4 ． 8 时浊度最低，蛋白质在p H4 ． 6 时含量最低。

( 2 ) 透明质酸的分离工艺。

除去发酵液中的菌体后，需要将透明质酸分离出来，这是一个初步纯化过程。

乙醇沉淀是分离各种多糖的一种方法，可以使透明质酸有效脱水、脱色，从而提高透明质酸产品质量。

乙醇添加量一般是发酵液体积的 2 倍旧，如果乙醇添加量足够大，透明质酸浓度低至0 ． 1 ％也可以完全沉淀。

预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对发酵液进行稀释，透明质酸常因稀释浓度低，直接采用乙醇沉淀，但这会消耗大量乙醇，因而浓缩可以减少乙醇用量。

膜技术不仅可以用于发酵液的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发酵液中的透明质酸也有一定可行性。

以膜技术为主体，采用微滤和超滤相结合的工艺，能够实现透明质酸发酵液的分离纯化。

( 3 ) 透明质酸的纯化工艺。

透明质酸的纯化主要用的是季铵盐纯化方法，氯化十六烷基吡啶( c P C) 是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起透明质酸与CPC复合物解离所需盐浓度远比其他黏多糖与C P C 复合物解离所需盐浓度要低，利用此性质可达到纯化透明质酸的目的。

在进入透明质酸纯化阶段后，离子交换法往往被采用，因为离子交换层析分离条件温和，不会引起分子结构的变化，已经成为分离提纯生物大分子的有效方法。

3透明质酸效用
3.1透明质酸的保湿性能
HA分子在溶液中高度伸展和随机卷曲构型使其占有很大区域，且分子链之间相互缠绕形成连续的网状结构，水分子通过极性键和氢键与其直接作用使得HA象分子海绵一样。

可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，是目前自然界中发现的保水性最好的天然物质，也是国际公认最好的。

在结缔组织中HA保水值
约为80 mL／g。

它与其他天然的或合成的聚合物相比具有更强的保水能力。

3.2 HA参与构成蛋白糖聚糖聚合体
在生理状态下，HA与其他糖胺聚糖(如硫酸软骨素、硫酸角质素等)协同连接到核心蛋白上构成蛋白聚糖聚合体。

这种巨型聚合体占很大水压域，在外界压力下可减少体积，压力解除后，又扩张到原体积，从而维持了组织的形状和体积，保证了组织的可逆性抗压缩力。

不同组织中蛋白聚糖聚合体(proteoglycans，简称PG)有其特殊功能。

3.3HA对细胞生物学的影响
Toole等人证明，胚胎和形态发生期HA的含量甚高，在分化期则由HA酶去除这些HA，产生分化性基质，如蛋白聚糖和胶元。

HA在分化期的作用是通过造成等渗性组织水肿。

导致细胞迁移所需的通道打开；帮助以上皮层释放出的间质细胞的分隔和转位；改变器官形态和结构。

3.4 HA对免疫细胞的作用
国内外的研究证实，HA对巨嗜细胞、粒细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)等均有一定作用。

低浓度的HA对吞噬细胞和NK的功能有轻度的促进作用，但对淋巴细胞的转化、E花环的形成有抑制作用;较高浓度的HA对淋巴细胞、NK细胞、吞噬细胞功能都有明显抑制作用，且有量效关系。

HA形成的细胞外衣(coat)，作为防止细胞毒性溶解的屏障，如神经胶质瘤的糖胺聚糖外衣可增强它对免疫杀伤细胞的抵抗作用；黏附在细胞上的HA外衣可阻断淋巴细胞介导的细胞溶解。

此外，这种HA外衣可防止病毒侵袭如新城疫病毒对入滑膜细胞的侵袭)，干扰细胞间凝集素与凝集素受体的作用。

3.5 HA对创伤愈合的影响
HA可加速创面愈合。

刨伤早期的局部HA浓度明显增高。

并对多种炎性细胞有调节作用。

高浓度、高相对分子质量的HA，具有较高的促愈合、调控胶元合成、调节纤维活性和抗炎等作用。

而低相对分子质量的HA则能刺激血管生成。

伤口中的HA在酶的作用下，降低成低分子HA，进而促进伤口愈合。

4 透明质酸的应用进展
( 一 ) 在化妆品方面的应用
透明质酸作用于皮肤表面，大分子透明质酸可在皮肤表面形成一层透气的薄膜，
使皮肤光滑湿润，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害；小分子透明质酸能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收、消皱增加皮肤弹性、延缓皮肤衰老等作用。

透明质酸还能促进表皮细胞的增殖和分化、清除氧自由基，可预防和修复皮肤损伤。

透明质酸的水溶液具有很高的黏度，可使水相增稠，使油相乳化后的膏体均匀细腻，具有稳定乳化作用。

因此，透明质酸已被广泛应用于膏霜、乳液、面膜、洗面奶、洗发、护发、润肤露等化妆品中。

( 二) 在临床方面的应用
透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。

可用作眼科人工晶体植入手术的黏弹剂，骨性关节炎和类风湿性关节炎等关节手术的填充剂，并且在眼科、鼻科、喉科、骨科和普外科等多方面取得了可喜的成绩。

( 三) 在药物中的应用
透明质酸作为媒介在滴眼液中广泛应用，不仅起到了增稠的作用，还可增加药物的生物利用度，并减轻药物对眼的刺激，促进眼部创伤愈合，迅速缓解眼部不适。

由于透明质酸钠的黏度比房水高5000倍，所以1 ％透明质酸钠注射剂注入前房后，可加深前房，维持前房一定空间深度，其滑黏性有利于异物取出和人工晶体植入等。

另外，透明质酸钠可作为滑润剂润湿眼球表面，防止上皮干燥，常用于治疗干燥性角结膜炎(干眼病)等。

还用于预防术后粘连和促进皮肤伤口的愈合，作为构成细胞外基质和细胞问基质的主要成分。

透明质酸与其他药物反应形成的化合物对药物发挥缓释作用，可达到定向和定时释放的目的。

( 四) 在保健品方面的应用
透明质酸已在欧美等发达国家中广泛应用于保健食品中。

通过口服透明质酸来增加体内的含量，来补充人体内透明质酸的不足。

透明质酸通过消化、吸收，可使人精力充足，富有青春活力；可使皮肤滋润光滑、柔软而富有弹性；可延缓衰老，防止关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症的发生。

5结论
透明质酸在眼玻璃体、关节腔中几乎以纯态形式存在。

它的水溶液为黏弹性流体，填充在细胞与胶原纤维空问之中且覆盖在某些表皮组织上。

在动物体，其主要功能是保护及润滑细胞，调节细胞在此黏弹性基质上的移动，稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。

存在于皮肤中的透明质酸，对人体表皮的新陈代谢起到重要的作用。

人体中透明质酸的破坏或失调，均可造成疾病。

皮肤中透明质酸含量的减少及破坏，可造成皮肤失水、起皱而失去弹性，使人表皮衰老，因而，透明质酸又被称为抗衰老因子。

在医药方面，透明质酸用于非甾体消炎药，是治疗关节炎、眼科、心外科手术的辅助药品，在治疗烫伤、烧伤、冻伤等方面，有着独到的作用。

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