发酵法生产透明质酸HA的分离和纯化
８０℃水浴烫１２ｓ，造成深Ⅱ‘烫伤（病理检查结果表明烫伤局部表皮消失，表皮、真皮及皮下组织血瞥扩张，皮下组织水肿，真皮、皮下组织中可见急慢性炎细胞授润，符合大鼠深Ⅱ‘羹伤）。羹后用妙布轻轻攘干承渍，先用０．１％新沽尔灭擦洗，再用０．０５％洗必泰藏消毒倒面。对ＨＡ组大鼠，将ＨＡ粉末卉喑撤在其被烫伤部位，使成均匀一层，每只给药量为（１４０±０．７）ｍｇ；对湿润烧伤膏组太鼠，将湿润烧伤膏用棉棒均匀涂抹于被烫伤部位；模型对照组不给任何药。单笼饲养。观察指标：ｄ７，ｄ１５的创面结痂面积和创面脱痂】敷合时间。实验结果进行ｔ检验．结果见表１。
裹１ｆＬａｔ糟束捌对太■谭Ｉ‘量仿的疗簸ｉ±５．ＲｔｌＯ
与曩翌坦帽比，１Ｐ＜０．０５，。１Ｐ＜０．０１
从表１看出，ＨＡ粉末剂对大鼠深Ⅱ‘水烫伤ｄ１５的剖面结癞面积、脱痴愈合时间与模型对照组相比有显著性差异；ＨＡ组与湿润烧伤膏组ｄ７的创面结痴面积和脱癞愈合时间两项指标相接近，而ｄ１５的剖面结病面积小于烧伤膏组，但无统计意义。
２．２ＨＡ粉末剂对大鼠浅Ⅱ‘水烫伤的治疗实验
按上法将羹伤溢度改为７０．Ｃ．烫伤时间为１５ｓ，造成浅Ⅱ‘烫伤，（病理检查结果表明烫伤局部表皮消失，表皮下血管扩张，表皮、真皮水肿，真皮及皮下组织中可见急性炎细胞浸润，符合浅Ⅱ‘烫伤）。分组、给药方法及观寨指标均同大鼠探Ⅱ。烫伤实验。结果见表２。
囊２肚糟末剂对大■穗Ｉ’曩仿的疗效；±ｌ。＾＝１０
与羹丑组相比，’Ｐ＜０．０５，’‘Ｐ＜０．０１
从表２看出。ＨＡ粉末剂对大鼠浅Ⅱ＋水烫伤ｄ１５的剖面结痂面积、脱痴愈合时间与模型对照组相比有显著性差异；ＨＡ组与烧伤膏组ｄ７、ｄ１５的创面结痴面积和脱痂愈合时间两项指标相接近。
３讨论
经以上动物实验证实，ＨＡ粉末剂具有良好的治疗烧烫伤作用。该制剂与软膏剂相比，蔗免了后者透气性差，易引起组织水肿的缺点，能够均匀分布在烧烫伤皮肤表面形成一层疏松隔商层，透气性好，可吸收刨面渗出液．有教地保护、封闭剖面，结痴面积较小，具有抑制疤痕组织生成及加速烧羹伤剖面禽合的功能。ＨＡ粉末剂还具有衡备工艺简单、稳定性好、易于大规模生产等优点。因此，ＨＡ粉末剂作为治疗烧烫伤新倒荆，有广晦的临床应用前景。（参考文献略）
发酵法生产透明质酸（ＨＡ）的分离和纯化
倪杭生李润（清华大学化学系北京１０００８４）
ＨＡ于１９３４年由美国的Ｍｅｙｅｒ和Ｐａｌｍｅｒ从牛眼玻璃体中首次发现的一种高牿性物质，但对透明质酸的研究与开发起步较晚。近年来，随着生物学、生物化学、生物分离技术和病理学的发展，逐步对ＨＡ的性质、结构、生理功能和药理作用有了新的认识，认为ＨＡ是一类有前途的新型生化药物。特别是ＨＡ的高粘性和高保水性的功能，在临床上有重要的地位，已经越来越引起人们的重视，从而推动了ＨＡ分离纯化与倒备的研究。本实验采用化学方法对从发酵液中提取的ＨＡ粗品分离纯化，取得了很好的效果。
ｌ实譬试剂
９１７
透明质酸粗品，山东橱瑞达制药有限公司；氯化钠、盐酸、氯仿，北京化工厂；氢氧化钠、９５％乙醇，北京益利精细化学品有限公司；澳代十六烷基毗啶，青蒲新产品研究所；三氯乙酸，北京顺义县李遂化工厂；五氧化－－Ｍ。北京化学试帮公司；活性炭，北京陶瓷绘料厂，试剂均为分折饨。
ＨＡ粗品坚姒的钠溶液警上清液卜０．Ｉ舭ｍｄ／Ｌ４．Ｈ晰ＣＩ，Ｑ一）ＣＨ）ＨＡ水相．０．．．．．．．ｉ．．ｍ．．．．ｏ．．．］．／．．．Ｌ．．．．．Ｎ．．．．Ｄ．．Ｏ．．．．Ｈ．．．．．，．．Ｃ．．．Ｐ．．．．Ｂ．．—Ｉ％—２工艺淹程
沉
ｐＨ＝７０．膏心
淀物』专：：；尝旦上清液Ⅱ｛暑上清液Ⅲ—！筹》上清藏Ⅳ』塑芸；菩旦蔓沉淀物—ｉｉ等ｆＨＡ精品
３撮作说啊
３．１除去蛋白质和不溶性杂质秫取ＨＡ粗品０．５４８０９，放置于烧杯中，加Ａ去离子求１００ｍｌ，加＾１．０ＲＮａＣＩ，放置２４ｈ，使其充分溶解。取上述ＨＡ的钠盐溶液约ｌＯＯｍｌ，加人２０ｍｌ５％（质量比）冷的ＣｈＣＣＯＯＨ，放置于冰水浴中充分搅拌３ｈ，再在０～４＂ｃ下放置５ｈ，使蛋白质完全变性后沉淀，高速离心分离，除去沉淀，得上清液Ｉ。
３．２除去脂类等致炎物质用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣＩ溶液调节ｐＨ值４．８，加入等体积的ｃＩ，ＣＨ，倒人分液漏斗中，充分振茴，使脂类溶解和剩余碡白质变性，静置分层后分出水相，对水相用Ｃ１３ＣＨ重复处理三次，再分出水相，漓加０．Ｉｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液，调节ｐＨ值至中性，得ＨＡ水相。
３．３除去其它粘多糖在ＨＡ水相中，加入１％ＣＰＢ，缓慢搅拌，形成粘多糖一ＣＰＢ的沉淀物，直至不再出现沉淀为止，放置２ｈ，低黼心分离，除去上清液，取沉淀物，在４０＂Ｃ时，用０．４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液解离０．５ｈ，
除去沉淀物，得上清灌Ⅱ。
３．４除去ＣＰＢ络合荆将上精液Ⅱ放置于冰箱中保存，直至上清液Ⅳ的温度低于５℃，在低温下高速离心分离，除去ＣＰＢ，得上清液Ⅲ。
３．５除去其它剩余杂质往上清液Ⅲ中加入２９／Ｌ的活性擞，充分搅拌１．５ｈ后，低温冷却，直至上清液Ｖ温度在低温状态下，高速离心分离，除去沉淀物，得上清液Ⅳ。
３．６沉淀ＨＡ经上述处理后的上清液Ⅳ，用ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ到一定值，加人三倍于溶液的９５％乙醇，立即产生大量的絮状沉淀，沉淀基本完成后，迅速用ＨＣｌ溶液至ｐＨ值中性，再静置一段时间，待沉淀完垒后，离心分离，取沉淀物。
３．７制得ＨＡ的精品上述沉淀物在室温下自然晾干，用Ｐ２ｑ真空干燥７２ｈ。得０．３６００９ＨＡ精品．收率为６６％。
４分析方法
４．１葡萄糖醛酸古量：参照Ｂｉｔｔｅｒ—Ｍｕｉｒ的咔唑法测定。以葡萄糖醛酸为标准品。
４．２萑白质含量：参照Ｌｏｗｒｙ法测定。以牛血清白蛋白为标准品。
４．３牯度及相对分子质量的测定：参照Ｓｈｉｍａｄａ法。采用乌氏粘度计。参比溶剂为ｐＨ＝７．３、０．２ｍｏｌ／Ｌ的礴酸盐缓砷液，测定捏度（２８±０．０５）℃，三点外推至比浓度为０，求出特性粘度［Ｔｊ］，并计算出相对分子质量。４．４紫外吸收光谱：采用岛津ｕＶ一２１０Ａ型紫外自动扫描分光光度计，扫描范围１９０～３００，速度１００ｎｍ／ｍｉｎ。
４．５红外系数光谱：采用ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ７８３型红外分光光度剂，分辨率为２．４ｅｒａ一，样品用溴化钾压片，在４０００～４００ｅｒａ。１范围扫描。
５结果与讨论
５．１根据ＣＰＢ，ＣＰＣ等长链季铰盐的溶解度曲线，选用ＣＰＢ作为与透明质酸等糖胺聚糖形成络合物的络台剂．解青后ＣＰＢ比ＣＰＣ容易析出，这样可以减少季铰盐对最终ＨＡ产品的污染。
暑２采用氯仿能够除去ＨＡ中的热源等至炎物质，同时能够使得未被三氯乙酸除去的噩白质变性析出，除蛋白质更韵底。
５．３乙醇沉淀ＨＡ水溶液时，如果有氯化钠的存在，一般辛茛度为１％左右，使ＨＡ以钠盐的形式存在．以减少ＨＡ分子问与分子内的氢链的作用力，使得况诧后的透明质酸成为粉末状形式析出。
５．４根据红外光谱图，在３３８０－－３４３０ｃｒａＪ１处有强烈的。一Ｈ伸缩振动的特征吸收带，表明存在着多羟基结９１８
构；在１６１３，１０４３。１５４２ｃｒａ－１处有Ｃ＝Ｏ和Ｃ～Ｎ伸缩振动及Ｎ—Ｈ弯瞳振动的吸收带，表明存在乙－酰氯基结构；在１４２７ｅｍ。处有Ｏ＝Ｃ一０的伸缩振动的吸收带表明存在糖醛酸上解离舶羧基和羟基结构。
５．５根据紫外光谱图，看出在２６０，２８０ｒｍａ处略有吸收，表明蛋白质和核酸的吉量非常低。
５．６经本工艺制得的ＨＡ的特性粘度为１４５９ｍｌ／ｇ．平均相对分子质量为７．４１×ｌ舻，氨基葡萄糖舶古量为３４．７３％，葡萄糖萑酸的含量为３７．４４％，蛋白质含量为０．３７％。（参考文献咯）
比浊法测定硫酸软骨素的含量
摄胜利崔甚斐谢清教１ｔ吉起王风山
（山东医科大学生化制药教研室济南２５００１２；１枣庄振兴生化制药厂２７７１４６）
硫酸软骨素（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅ，ｃｓ）是我国重要的出口创忙生化药物。国内采用的含量测定方法有多种，如分光光度法、重量法、氨基己糖法、葡萄糖醛酸法等，其中氨基己糖法是卫生部部颁标准收霸的方法。这些方法豫操作较为繁琐外，结果的重现性较差。目前国外多采用高效液相色谱法，但国内许多Ｃｓ生产厂家不具备该法所需的仪器设备条件。本实验利用ｃｓ聚阴离子可与有机碱氯代十六烷基吡啶（ｃｅｔｙｌｐｒｉｄｉｎｉｕｍｃｌ＇曲ｒｉｄｅ，ｃＰｃ）结合形成稳定乳浊菠的性质，建立了ＣＳ含量的比浊测定法。
１材料
ｕｖ一１２０—０２型紫外可见分光光度计，日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司。ｃＳ样品，枣庄振兴生化制药厂，批号为９８１２０９，９８１２１４，９８１０１０；ＣＳ—Ｎａ对照品，含量为９９．５％，Ｓｉｇｍａ产品；样品与对照品的潜藏均为２．０ｍｏｌ／Ｌ的乙酸钠溶液；ＣＰＣ，上海试剂一厂，ＡＲ，批号９６１１０１；盐酸氨基葡萄糖。ＢＲ＇，上海雨珠东风生物技术有限公司；可溶性淀糟、牛血清白蛋白等均为国产分析纯或化学纯试剂。
２方法和站果
２．１ｃＰｃ涮定法的建立
２．１．１测定波长的选择分别配制ＣＳ对照品溶液１００ｐｇ／ｍｌ和２５０ｐｇ／ｍｌ，在４００～７６０ｎｍ波长范围内进行吸收度扫描，结果显示在此波长范围内的吸收度是恒定的。由于一般的ｃｓ产品常言有在４００～６５０ｎｍ有光吸收舶有色杂质，为避免其对测定结果的干扰，故选择测定波长为６８０ｎｍ。
２．１．２稳定性试验精密量取对照品液（１００，２５０．ｇ／ｍ１）２．０ｍｌ于试管中，加入０．２％ＣＰＣ溶液２．Ｏｍｌ，充分振播，室温放置，在１０～１８０ｍｉｎ时间内每隔１０ｒａｉｎ在６８０ｎｔｏ测定吸收度Ａ∞ｏ。。结果表明，在３０－－１２０ｒａｉｎ时Ｉ可内，Ａ６８０。保持恒定，ＲＳＤ分别为０．１８％和１．２５％（ｎ＝７）．故确定在ｃｓ与ＣＰＣ反应ｌｈ进行罚定。２．１．３线性关系的考察精密量取ｃＳ对照品溶液（２５０ｐｇ／ｍ１）０，０．１，０．２，０．４，０．６，…，２．Ｏ“，分别置试管中，加２．０ｍｏｌ／Ｌ的乙酸钠溶液至２．０ｒａｌ。各管加人０．２％ＣＰＣ溶液２．Ｏｍｌ，充分振播，室温放置ｌｈ后测＾∞。。结果表明，ｃｓ在浓度为２５～２５０ｐｇ／ｍｌ范围内，Ａ６８０。在０．１～１．０之间，回归方程为Ｃ＝（Ａ一０．０１２４）／０．００２３１．ｒ＝０．９９６２（ｎ＝１２）。
２．１．４回收率试验精密量取对照品液适量，同标准曲线项下操作，进行加样回收。测得平均回收率为１００．２％，Ｒ∞为０．３１％，ｎ＝５。
２．１．５干扰暂质试验选用蛋白质、淀粉和盐酸氨基葡萄糖作为干扰因素进行试验。配制ｌＯＯｇｇ／ｒａｌ的ｃｓ对照品溶液，其浓度按１００％计，各干扰物质在此溶液中的古量及对测定结果的影响见表１。
寰１鲁干扰相质的音量爰对一定结果的影响
２．１．６标准曲线的镧备精密称取经１０５＂Ｃ干燥至恒重的ＣＳ对照品２５ｍｇ，置１００ｍｌ量瓶中，加２．０ｍｏｌ／Ｌ的乙酸钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取０，０．２，０．４，０．６．Ｏ．８。１．０ｍ１分烈置备试管中，加２．０ｍｏｉ／Ｌ
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发酵法生产透明质酸(HA)的分离和纯化
作者：倪杭生， 李润
作者单位：清华大学化学系(北京)
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透明质酸(HA)是国际公认的理想的天然保湿因子,用于高档护肤品、发用制品;在医学方面可制备成眼科制剂和骨科制剂等;在日本还是美容保健食品.HA的生产方法有发酵法和提取法两种.在发酵法生产HA选择菌种时,要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题.若以链球菌为菌种生产HA,从代谢调控的角度来说,有氧发酵有利于HA的合成.在HA的发酵过程中
,pH值是一个重要的因素,一般控制在6.0～8.5的范围内.目前国内HA的发酵产率为4～6g/L,国际先进的HA发酵产率为6～7g/L.发酵法是HA生产的发展方向,但还应从提高产率、提高产品分子量和分离纯化技术方面进一步深入研究.
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3.学位论文孟庆繁兽疫链球菌发酵法生产透明质酸2003
本文以兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)C55151为原始菌种，经N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)诱变处理，获得一株透明质酸(Hyaluronicacid，HA)产量较原始株提高一倍的变异株J18；通过对C55151原生质体用He-Ne激光(功率密度为40mW/cm2,照射时间为300s)照射诱变，其致死率可达99.88％，从存活的变异株中筛选出一株HA产量较原始菌株高4.5倍的高产菌株。同时对变异株J18发酵条件和C55151菌株原生质的制备和再生条件进行研究。
将兽疫链球菌经诱变后产生的多糖经Savage法、季铵复合物沉淀法、DEAE-纤维素(DE52)离子交换层析法及SephadexG-75凝胶过滤法分离纯化；纯化的多糖的结构经过化学组成分析、核磁共振光谱、红外光谱及圆二色谱进行鉴定，证明了诱变得到的高产菌株J18经发酵产生的多糖为透明质酸；通过刚果红实验证明了透明质酸的构象为单股螺旋结构；并测得该透明质酸的平均分子量约为1.16×106D。
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研究了兽疫链球菌直接上发酵罐生产透明质酸的条件,考察培养基配方、温度、通气量、pH值、葡萄糖浓度等对产物得率的影响,获得了较佳的培养基配方:葡萄糖70 g/L、酵母粉25 g/L、硫酸镁5 g/L、磷酸二氢钠5 g/L、维生素B1 1.0g/L,较佳发酵工艺条件为:培养温度为36±1 ℃、通气量为2.0 vvm、pH值为6.80±0.1.在此条件下透明质酸的产率为7.06 g/L.研究结果表明,直接上发酵罐生产透明质酸的方法,不仅减轻了劳动强度,而且节省了种子罐的生产环节,减轻了染菌机率.
6.学位论文石艳丽透明质酸发酵培养基的优化及其对生产菌透明质酸合酶表达的影响2004
透明质酸(HA)是由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的高分子直链黏多糖,广泛存在于脊椎动物的软组织如皮肤、关节滑液、眼玻璃体中.由于HA具有黏度高、保湿性好等特点,已广泛应用于医药、化妆品等领域.目前HA的生产主要有提取法和发酵法.由于发酵法生产HA有不受原料限制、产物易纯化等优点,已成为生产HA的主流.发酵法所用的微生物链球菌对营养要求苛刻,不同培养基原料对HA产量的影响很大.对HA产量影响较大的培养基原料主要是蛋白胨和酵母粉,这些原料由于受其工艺水平的限制,不同厂家甚至是同厂家不同批号之间也有较大的差异,从而影响HA发酵生产的产量稳定性.另外,细胞通透性调节剂也可能影响HA发酵产量.因此,为了稳定和提高HA发酵生产的产量,有必要考察各种因素对HA发酵的影响.本研究探讨了不同营养元素、细胞通透性调节剂对HA发酵产量的影响,优化了HA发酵培养基,并研究了优化培养基对生产菌HA合酶表达的影响.
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8.学位论文刘金龙透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究2007
透明质酸(Hyaluronic acid)是一种具有生物相容性的高分子聚合物。由于特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力，透明质酸在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。
目前，透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术就显得十分必要。
本文对微生物发酵法生产透明质酸进行了的探索，主要完成了以下几个方面的工作，并得到了相关结论。
确定了摇瓶发酵培养基的适宜组成。通过500毫升摇瓶水平的单因素试验和多因素正交试验初步确定菌株发酵培养基的成分。即葡萄糖浓度40g/L、蛋白胨浓度10g/L、酵母粉浓度10g/L、K<,2>HPO<,4>浓度2 g/L、MgSO<,4>'7H<,2>O浓度0.4g/L。
确定了菌株摇瓶发酵的适宜培养条件。绘制出种子培养基中菌体的生长曲线，取14h为接种的适宜种龄，发酵培养基中的适宜装液量确定为30ml/500 ml，产物HA积累的最适温度为34℃，最适初始PH值为7.4。
确定了小罐发酵适宜培养条件。在发酵罐水平上探索了适于产物代谢的适宜温度为34℃和PH值为7。摸索出适于产物积累的通氧和搅拌策略，即整个发酵过程采取较低的通氧速率5L/min，搅拌速率分两阶段调控，先采用低搅拌速率300r/min，待溶氧将下来以后，再采用高转速600r/min的调控方式，发酵效果较佳。在线控制发酵过程中的补料方式，摸索出了最适于产物积累的补料方式，在对数生长期进行葡萄糖的类指数补料的方式透明质酸的产量最高。
确定了透明质酸的分离提纯工艺。经过一系列提取纯化步骤：乙醇沉淀、沉淀物溶解、过滤、CPC络合、HA-CPC解离、成品沉淀、脱水、真空冷冻干燥等，得到成品。成品最终的各项指标接近于化妆品级的标准。整个提纯工艺的收率在75％左右。
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透明质酸(Hyaluronic acid简称HA),是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域.本文综述了目前国内外对透明质酸的化学结构、理化性质以及生产方法等方面的研究现状,对透明质酸的线性结构、超强吸水性以及它与水结合成的粘弹性透明水化膜,在润肤、恢复软组织等方面的应用作了较详细的论述,对采用动物组织为原料的提取法和采用兽疫链球菌等为菌种的发酵法作了较系统的介绍.
10.会议论文丁霞.张建法.蒋鹏举透明质酸的生物合成及生产2002
本文概述了透明质酸的分子结构,性质,生物合成及应用,重点阐述了透明质酸链球菌生物发酵法的生长与提取方法和工艺,提出了透明质酸的未来研究方向.
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药物分离与纯化技术提纲(自制).
第一章绪论 1.药物分离与纯化过程分为机械分离与传质分离，机械分离针对非均相混合物，传质分离（物质传递）针对均相混合物，分为平衡分离过程与速度控制分离。 2.分离剂可以是能量或物质（质量）。 第二章药物分离纯化前的预处理技术 1.预处理的目的：将目的产物转移到易于分离的相态中（液相），同时除去大部分杂质，改变流体特性，利于后续分离。 2.药物成分的形成阶段只能获得含有目的药物成分的混合物，难以进行药物分离。 3.预处理主要完成任务： （1）去除大部分可溶性杂质（阳离子、生物大分子） （2）采用凝聚或絮凝技术，将胶体状态的杂质转化为易于分离的较大颗粒。（3）改善料液的流动性，便于固液分离 （4）固液分离 （5）将胞内产物从细胞内释放出来 4.沉淀技术： （1）高价离子：Ca2+、Mg2+、Fe3+ a影响离子交换 b对药物降解加速催化作用 （2）生物大分子（可溶性黏胶状物）：蛋白、核酸、多糖 a粘度增大，影响固-液分离。 b乳化作用，吸附离子基团。 5.沉淀法去除杂质常用的方法：等电点沉淀法，变性沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法，反应沉淀法。 6.等电点沉淀法原理：蛋白质是两性电解质，当溶液PH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。
7.变性沉淀法原理：利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 8.盐析法概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 9.盐析法影响因素： （1）盐析剂的性质和加入量 （2）溶液的pH值 （3）蛋白类化合物的性质 （4）蛋白浓度 （5）温度 10.常用的凝聚剂：AlCl3·6H2O、Al2(SO43·18H2O(明矾）、 K2SO4·Al2(SO43·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4和MgCO3等。 11.凝聚作用与絮凝作用的区别：凝聚作用是指某些电解质（凝聚剂）作用下，破坏胶体系统分散状态，而使胶体粒子聚集过程，而絮凝作用是通过架桥作用将许多微粒聚集在一起，形成粗大的松散絮团的过程。 12.助滤剂：具有一定刚性的颗粒或纤维状的固体。 13.常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性碳等。 14.细胞破碎方法 （1）机械法：高压均浆法（可大规模操作），珠磨法（可较大规模操作）、超声破碎法、X－press法 （2）非机械法：酶解法、化学渗透法、渗透压法、冻结融化法、干燥法。 15.高压匀浆法原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 第三章萃取技术
微生物发酵法生产透明质酸
微生物发酵法生产透明质酸 郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。 1 透明质酸的发展 1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。 由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。 工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。提取法和发酵法生产HA的比较见表1。 表1 提取法和发酵法生产HA的比较
项目提取法发酵法 存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖 形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易 分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大 价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg 应用价格昂贵，化妆品中的添加量 受到制约 能增加化妆品中的添加量 发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后 化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。山东省生物药物研究院（原 山东省商业科技研究所）是国内最早从事HA研究开发的单位之一，1990 年该院郭学平等在国内首先开始HA的发酵生产研究，先后完成了小试和中 试实验。发酵法生产HA的研究成功改变了我国HA生产技术的落后局面， 使我国HA的生产进入了新的发展时期。 2 化学结构及理化性质 HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛 酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，见图1。
提高D-酪氨酸生产效率的方法与相关技术
图片简介: 本技术介绍了一种提高D酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。本技术通过分子生物学手段构建了一株双质粒共表达的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L酪氨酸转化为D酪氨酸，并通过偶联辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH循环再生，转化能够高效进行。并通过优化全细胞转化条件，实现了D酪氨酸的高效生产。通过本技术生产的D酪氨酸产量可达8.4g/L，转化率达93％。 技术要求 1.一种生产D-酪氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。 2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱 氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。 3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶选自奇异变形杆菌， 所述D-氨基酸脱氢酶选自谷氨酸棒状杆菌，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。 4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。 5.一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一 所述的重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生系统。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化条件是：pH 7～9，转化温度为15～37℃，转化时间20～24h。 8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用权利要求1-4任一所述的重组菌的湿细胞进行转化。 9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～ 1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～0.6mmol/L。 10.权利要求1-4任一所述的重组菌在食品、制药或化工领域的应用。 技术说明书 一种提高D-酪氨酸生产效率的方法 技术领域 本技术涉及一种提高D-酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。 背景技术 D-酪氨酸是一种非天然手性氨基酸，是多肽药物和抗肿瘤手性药物的重要中间体。以D-酪氨酸为手性前体可合成阿托西班、多肽、茴香霉素等物质，其中，阿托西班是一种保胎药；多肽在恶性肿瘤的治疗中具有特殊疗效；茴香霉素能够抗原虫、抗真菌、抗变形虫和抗肿瘤。
发酵法生产透明质酸
发酵法生产透明质酸 透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。 透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。 微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂．并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。 发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。 一.发酵部分： 经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块： 1.菌种的筛选 2.菌种的诱变 3.培养基配方的优化 4.菌株的最佳培养条件 首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。
天然产物分离与纯化
茶叶中茶多酚的提取分离纯化重庆大学课程论文 学生姓名：何英 学号：20161902017t 专业：生物学 学科门类：理学 重庆大学生物工程学院 二O一六年十月
摘要 茶叶中含有600多种化学成分，组分极为复杂。茶叶中的无机矿物质有27种，大多数都是人体健康所必须物质。茶叶中的有机物茶多酚与儿茶素类物质、咖啡碱、茶多糖等决定了茶叶色泽、香气、滋味、营养及保健功效。本文总结了茶多酚为主要内容物的提取纯化及性质为主要内容，对比不同方法的优异，按要求选择一条合适的工艺路线。溶剂浸提法工艺简单、技术成熟。离子沉淀法选择性强、纯度较高但是损失大、收率低、安全性低。树脂吸附法虽工艺简单、纯度高、能耗低但是溶剂用量大、成本高。超临界流体萃取法纯度高但是设备要求高、成本高，不适合大剂量的提取茶多酚。超声波浸提法高效、节时、提取率高但噪音污染，不适合长期使用。微波浸提法高效、节能、节时、提取率高但具有微波辐射。膜分离法工艺简单，环境污染小但纯度低。所以根据不同的要求、设备、成本需要选择不同的方法。 关键词：茶叶，茶多酚，提取方法
1绪论 茶叶起源于我国，后流传于世界。至今，地球上引种茶树的国家已经达到了60多个，近年来世界茶叶种植面积总数达290万公顷[1]。我国是产茶大国，进入21世纪以来，我国的茶产量稳居世界第一[2]。科学研究和临床医学实验表明，茶叶有降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、抗辐射等诸多保健作用，这与茶叶中的有效功能成分密不可分。茶叶中的有效成分包括茶多酚、茶多糖、咖啡碱、茶氨酸、茶蛋白等。所以，用中低档茶叶为原料，提取分离有效成分，大力发展茶叶深加工技术，不仅可以开辟中低档茶叶市场、充分利用茶叶资源，也将成为我国茶叶行业发展的新方向。 茶多酚作为茶叶中最主要的功能性成分，使其成为目前天然产物研究的热点，由于具有多种生理活性和功能，在医疗保健、食品行业、日用品等领域都得到了广泛的应用。因此，优化提取工艺，分离提纯茶多酚具有十分重要的经济和社会效益。目前，国内茶多酚生产企业基本上采用的是溶剂法制备茶多酚，该方法生产周期长，温度高，所制备的茶多酚含量和活性低，且由于在生产过程中使用氯仿等有机溶剂，不仅操作不安全，产品还存在有毒溶剂残留问题，其品质难以满足国内外市场的需求，造成茶多酚产品销售困难，大量积压，同时溶剂法对环境的污染较大，不符合绿色化生产发展的方向。因此，需要选择一条合理，绿色，创新的生产工艺，提高茶多酚产品的质量，实现资源、环境、经济、社会一体化发展。
透明质酸的制备
透明质酸的生产工艺 透明质酸（HA ）的生产工艺主要分为二大类,以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。透明质酸在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有 的动物组织中均含有透明质酸，只是含量 不同。已从下列组织中分离出了透明质酸：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（Ｍr ）有差别。 一、以雄鸡冠（roostercomb）为原料的生产工艺 （一）、工艺路线： （二）、工艺流程 1．提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg 鸡冠加水8L ，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温 10min ，冷却至50℃，用1mol/L 氢氧化钠液调pH8.5~9.0, 加入适量胰酶,45~50 ℃保温酶解5~7h ，酶解过程中维持 pH8.5~9.0 。 2．过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调pH6.0~6.5, 将滤液加到3 倍体积的95%乙醇中,反复倾倒3 次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出沉淀,用适量乙醇脱水3~5 次,放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥,得透明质酸中间品。 4．氯仿处理将透明质酸中间品溶于0.1mol/L 氯化钠溶液中,溶解浓度为0.3%, 溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后，调pH4.5~5.0,加入等体积的氯仿搅拌处理2 次,静置分出水相。5．酶解将水相用稀氢氧化钠溶液调 pH7.5, 加入适量链霉蛋白 酶,37℃酶解24h。 6．络合沉淀酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十 六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC 络合沉淀。7．解离将
典型生产案例酒精等发酵产品
典型发酵产品介绍传统发酵产品现代发酵产品本章要求熟悉传统及现代发酵产品四微生物酶制剂生产工艺举例 a －淀粉酶生产工艺微酸性固体曲法霉菌中性至微碱性液体深层发酵细菌微生物培养条件微生物培养法菌种一般在酶活达到最高峰时结束发酵离心以硅藻土作为助滤剂去除菌体及不溶物在钙离子存在下低温真空浓缩后加入防腐剂稳定剂以及缓冲剂后就成为成品为制造高活性的淀粉酶并便于贮运可把发酵液用硫酸铵或有机沉淀剂沉淀制 成粉状酶制剂最好贮藏在25C以下较干燥避光的地方利用蛋白酶 比淀粉酶的耐热性差的特点将 a -淀粉酶的发酵液加热处理可以使淀粉酶的储藏稳定性大为提高在培养基中添加柠檬酸盐可抑制某些菌株产生的蛋白酶用底物淀粉进行吸附也可将淀粉酶和蛋白酶进行分离一米曲霉固态法a-淀粉酶生产工艺1生产工艺流程试管斜面培养基J三角瓶种子J种曲培养J厚层通风培养J烘干 J粗酶制剂J酿造等用粉碎J抽提J过滤J沉淀J压滤J烘干J成品J供助消化药酿造等用J调配2发酵将试 管斜面于32?34C培养70?72h接种到500mL三角瓶每瓶一菌耳种菌摇匀于32?34C下培养3d每24h扣瓶一次以防结块待菌体大量生长孢子转出黄绿色时即可作为种子用于制备种曲种曲房要保持清洁并定期用硫磺和甲醛熏蒸灭菌种曲培养一般采用木制或铝制曲盒培 养基经高温灭菌后放入种曲箱房打碎团块冷却到30C左右接入05?1％的三角瓶种子拌匀后放入曲盒料层厚度1cm 左右为宜盒上盖一层 布后放入专用的木架上曲房内保持30 C左右进行培养盖布应每隔
8?12h 用水浸湿以保持一定湿度每24h 扣盘一次经3d 后种曲成熟麦 麸上布满黄绿色孢子 厚层通风固体发酵蒸煮 1h 后培养基冷却到 30C 接入05%的种曲拌匀后入池发酵前期品温控制在 30C 左右每隔 2h 通风20min 当池内品温上升至36C 以上时则需要连续通风使温度 控制在34?36C 当池内温度开始下降后 2?3h 则通冷风使品温下降 到20C 左右出池整个发酵过程约需要 28h 2提取 直接把麸曲在低温 下烘干作为酿造工业上使用的粗酶制剂特点是得率高制造工艺简单 但酶活性单位低含杂质较多 把麸曲用水或稀释盐水浸出酶后经过 滤和离心除去不溶物后用酒精沉淀或硫酸铵盐析酶泥滤出烘干粉碎 后加乳糖作为填充剂最后制成供作助消化药酿造等用的酶制剂特点 是酶活性单位高含杂质较少但得率低成本高 二枯草杆菌 BF-7658 深 层液体发酵a -淀粉酶生产工艺枯草杆菌BF-7658淀粉酶是我国产 量最大用途最广的一种液化型 a -淀粉酶其最适温度 65C 左右最适 pH65左右pH 低于6或高于10时酶活显著下降其在淀粉浆中的最适 温度为80?85 C 90 C 保温10min 酶活保留87% 1生产工艺 无菌空 干燥J 粉碎J 混粉J 成品J 硫酸铵补料 72 h 使菌体全部形成孢子即为成熟 种子培养维持 罐温37C 罐压05?08 atm10h 后加大通风当菌体处于对数生长期后 期立刻接种至大罐种子培养一般14h 左右 发酵控制温度37C 罐压05 atm 通气量0?12 h 控制05?06 VVM12 h 后控制在08?10 VVM 发酵 后期控制在 09 VVM 发酵培养一般采用补料工艺一方面可解除分解代 谢阻遏效应另一方面也有利于 pH 的调节最终达到提高产量的作用补 料体积和基础培养基体积一般为 13左右从 10 h 左右开始补加一般前 期后期少中期大根据菌体的生长情况来调整 当pH 低于65细胞生长 粗 气 BF-7658 菌种 J 孢子斜面J 种子罐J 发酵罐f 热处理J 罐7硫酸铵废液 J 填充料2发酵孢子培养一般采用马铃薯培养 基于37 C 下培养
微生物发酵法生产透明质酸的研究
燕山大学 课程设计说明书微生物发酵法生产透明质酸的研究 学院（系）：环境与化学工程学院 年级专业：10生物化工 学号：100110050050 学生姓名：王伟伟 指导教师：张晓宇 教师职称：副教授
燕山大学课程设计（论文）任务书 院（系）：环境与化学工学院基层教学单位：生物工程系
燕山大学课程设计成绩评定表
2013 秋季学期 生物工程专业课程设计 结题论文 微生物发酵法生产透明质酸的研究 学院（系）：环境与化学工程 年级专业：10 生物化工 学号：100110050050 学生姓名：王伟伟 指导教师：张晓宇 教师职称：副教授
为提高微生物发酵生产透明质酸的质量，本设计选用经过突变后的高产兽疫链球菌株做为发酵用的菌种，并且在发酵前经过了严格的灭菌操作。设计内容主要分为三部分：摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响；培养条件对发酵结果的影响；通过发酵过程中各种参数的变化优化发酵条件。第一部分设计拟采用正交设计法确定最合适的种子培养基；第二部分设计拟单因素分析法确定外界最适发酵条件；第三部分通过测定发酵过程的各种参数绘制参数变化曲线，为发酵条件的优化提供科学依据。通过本次设计，制定出兽疫链球菌生产透明质酸的合适工艺流程。 关键词：透明质酸；兽疫链球菌；正交设计；单因素分析
第一部分文献综述 1 透明质酸 (1) 1.1 概述 (1) 1.2 结构 (1) 1.3 HA理化性质 (2) 1.4 HA的合成和代谢 (3) 1.4.1 HA的合成 (3) 1.4.2 HA的代谢 (4) 1.5 HA的生理功能 (5) 1.5.1 构成多种基质 (5) 1.5.2 保水、润滑、渗透压调节及分子排阻效应 (6) 1.5.3 对细胞的作用 (6) 1.5.4 与蛋白质的结合及其作用 (6) 1.6 HA的应用 (7) 1.6.1 HA在化妆品领域的应用 (7) 1.6.2 HA在医学领域的应用 (8) 1.6.3 HA在食品领域的应用 (8) 2 HA的制备 (9) 2.1 从动物组织中提取 (9) 2.2 微生物发酵法 (10) 3 国内外发展概况及其市场发展前景 (11) 第二部分课程设计 1.材料 (14) 1.1 试验用的仪器 (14) 1.2 试验药品 (14) 2. 方法 (15) 2.1 细菌发酵法生产透明质酸的工艺路线 (15) 2.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺流程 (15) 2.2.1 摇瓶种子液的培养 (15) 2.2.2 种子罐种子液的培养 (16) 2.2.3 发酵 (16) 2.2.4 下游分离纯化 (16) 2.3 检测方法 (16) 2.3.1 HA 含量的检测方法（Bitter-Muir 咔唑法） (16) 2.3.2 还原糖的测定方法—DNS法 (17)
发酵法生产维生素E
发酵法生产维生素E 一．部门人员分配：市场部邢卫强万军训 技术部周焱罗刚 品控部曹卫东 总经理汤隽语二．市场部：①维生素E的结构 维生素E结构式 维生素E定义： 一组脂溶性维生素，包括生育酚类、三烯生育酚类。都有抗氧化功能，为动物正常生长和生育所必需。 中文名称：维生素 英文名称：vitamin E 外观：透明粘稠液体 颜色：微黄绿色 分子式：C29H50O2
分子量：430 维生素E的功能与用途：维生素E （Vitamin E）是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。生育酚能促进性激素分泌，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末稍血管扩张，改善血液循环，预防近视发生和发展 维生素E（Vitamin E）是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。生育酚能促进性激素分泌，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、
烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、 美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼 睛晶状体内的过氧化脂反应，使末稍血管扩 张，改善血液循环，预防近视发生和发展 三确定维生素E的生产菌种，工艺流程。 生产菌种：外硫代红叶植菌 工艺流程： 外硫代 发酵原料 红叶植菌 活化预处理 扩大培养发酵培养基的配 进一步扩大培灭菌 代谢产物和细胞的分离 大型发酵 细胞的加代谢产物的分离副产品和废物处理 代谢产物的纯化或加工
氨基酸生产工艺
氨基酸生产工艺 主讲人：韩北忠 刘萍 氨基酸是构成蛋白成分 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 氨基酸 α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。 氨基酸的用途 1. 食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 2. 饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3. 医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 4. 化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 氨基酸的生产方法 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。 生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品, 1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原
发酵法生产γ-亚麻酸技术
发酵法生产γ-亚麻酸技术 一、简介 γ-亚麻酸Gamma linolenic Acid；通用名异亚麻酸。（十八碳三烯酸，维生素F，Octadecatrienoic Acid，GLA），分子式：C18H30O2。 目前国内外生产的γ-亚麻酸主要来源于月见草。此植物原产于北美，我国东北地区也有野生，近年来国内已进行大面积的人工栽培，仅吉林延边地区1988年的种植面积即达2O00公顷。 本品是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体。作为人体内必需的不饱和脂肪酸，成年人每日需要量约为36mg／kg。如摄入量不足，可导致体内机能的紊乱，引起某些疾病，如糖尿病、高血脂等。 二、γ-亚麻酸的营养保健作用 1、抗心血管疾病作用 血栓素A2(TXA2)是内源性最强烈的血小板聚集剂和血管收缩剂，而前列腺环素(PGI2)为最强烈血管扩张剂。正常机体两者保持平衡，以维持血小板生理作用。一旦TXA2合成增多，PGI2生成减少，则增加血小板聚集作用，引起血栓。γ-亚麻酸抗血栓心血管机理：(1)GLA作为PGE1前体抑制血小板聚集；(2)GLA转化成DHA，γ-亚麻酸抑制血小板TXA2合成酶活性。因此对血栓症方面，γ-亚麻酸具有减轻的效果，可降低引
起血栓性心脑血管疾病的危险外，它也能抑制动脉粥样状硬化症的形成，保护缺血性心肌，减少坏死区，维持血小板的正常功能。 2、降血脂作用 γ-亚麻酸作为PGE1的前体可降低总胆固醇，γ-亚麻酸能增大胆固醇的 极性和水溶性，使之易被酶解，还可从血液中清除甘油三脂，减少内源性胆固醇的合成，从而减少β－脂蛋白的生成。因此，γ-亚麻酸能降低 血液中总胆固醇含量，起到降血脂的作用。γ-亚麻酸是目前报道的治疗高血脂症疗效较佳、安全性最高的药物。 3、降血糖作用 由γ-亚麻酸组成的磷脂可以增强细胞膜上磷脂的流动性，增强细胞膜受体对激素(包括胰岛素)的敏感。由γ-亚麻酸而来的前列腺素等活性物质，可以提高胰岛β-细胞分泌胰岛素的功能。而γ-亚麻酸作为多不饱和脂肪酸还可以帮助恢复糖尿病人细胞的脂肪酸去饱和酶的活性。 4、抗癌作用 γ-亚麻酸可作为潜在的抗癌药物。对γ-亚麻酸的研究表明，它具有明显的抗脂质氧化作用，因γ-亚麻酸在体内首先被氧化，从而减轻了细胞脂质过氧化损害。研究表明,γ-亚麻酸可抑制人肝癌细胞生长。抑制人结肠癌、胃癌和胰癌细胞DNA的合成,γ-亚麻酸加Fe(II)对治疗乳腺癌效果 显著。
药物分离纯化
1.什么是化学萃取？影响化学萃取的因素？溶质与萃取剂之间的化学作用？ 2.什么事截留分子量？各种分离膜（如微滤、超滤、纳滤）的截留组分范围怎样？ 3.什么是乳化现象？消除乳化的方法有哪些？ 4.什么是反萃取、萃取相、萃余相？ 5.什么是有效成分和有效部位？ 6.什么是双水相萃取技术？有哪些特点？ 7.什么是半仿生提取法？其优点有哪些？ 8.什么是分子印迹技术，其特点如何？ 9.什么是分子蒸馏，其操作过程如何，有哪些特点？ 10.依据分离记理，色谱法分为哪几类？ 11.根据料液和溶剂的接触和流动情况，萃取操作过程如何划分？ 12.什么是凝胶色谱，其分离机理如何，有哪些用途？其操作过程如何？ 13.什么是住色谱，如何操作？ 14.活性氧化铝有哪些类型？特点是什么？其含水量关系如何？ 15.何为浸漉法，去操作过程如何？ 16.离子交换树脂有哪些类型,影响其选择性的因素？其操作过程如何？ 17.容积提前中药有效成分时，选择溶剂的原则，常见容积大机型大小如何？ 1分离纯化过程：通过物理、化学或生物等手段，或将这些方法结合，将某混合物系分离纯化成两个或多个组成彼此不同的产物的过程。 分离纯化技术：在工业中通过适当的技术手段与装备，耗费一定的能量来实现混合物的分离过程，研究实现这一分离纯化过程的科学技术。 1、药物分离的特点：（1）药物的品种繁多，结构复杂，不同来源的药物性质差别很大，采用的分离技术原理和方法也多种多样。（2）以天然形式存在的药物，或生物来源的药物通常含量较低，杂质的量远远大于有效成分的量。分离过程需要多种方法联合应用，使有效成分的含量不断提高。（3）药物中很多品种特别是天然成分和生物活性物质具有稳定性差、易分解、易变性等特点，在选择分离方法时需要考虑被分离物质的性质，采用适当的分离方法和条件，以保证产品的稳定性（4）从药物研究到药品生产，分离在量上的差别很大，小到 以鉴定、含量测定的6- 10g级，大到生产的吨级的纯化。（5）药品的质量要求高，必须达到国家标准，生产环境需要达到一定的洁净度，防止环境对产品的污染。 2、分离纯化方法按原理分为机械分离和传质分离。 3、萃取：将样品中的目标化合物选择性地转移到另一相中或选择性地保留在原来的相中（转移非目标化合物），从而使目标化合物与原来的复杂机体相互分离的方法。反萃取：调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。萃取相：当溶剂与混合液混合后成为两相，其中一个以萃取剂为主（溶有溶质）的称为萃取相。萃余相：另一个以原溶液为主的（即溶剂含量较低）称为萃余相。萃取液：利用蒸馏、蒸发和结晶等方法除去萃取相中的溶剂后得到的液体称为萃取液。萃余液：利用蒸馏、蒸发和结晶等方法除去萃余相中的溶剂后的液体称为萃余液。化学萃取：也称反应萃取，是利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。影响化学萃取的因素：（1）被萃取药物的结构（2）pH的影响（3）温度的影响（4）无机盐的存在（5）溶质的结构（6）萃取剂（7）稀释剂。 4、化学萃取中，溶质与萃取剂之间的化学作用主要有：（1）配位反应（2）阳离子交换反应（3）离子缔合反应萃取（4）协同反应萃取。 5、根据料液和溶剂的接触和流动情况，可以把萃取操作过程分成单级萃取操作和多级萃取
色氨酸发酵工艺原理及工业生产
湖北大学 发酵工程与设备课程设计 题目色氨酸发酵工艺 专业年级 08生物工程 学生姓名赵雄峰 学号 2008221107100168 指导老师李亚东 2011 年 6 月 4 日
目录 1前言------------------------------------------------3 2发酵机制--------------------------------------------6 3发酵工艺及特点--------------------------------------7 4菌种的制备及种子的扩大培养--------------------------9 5培养基的组成及制备----------------------------------12 6无菌空气制备系统-----------------------------------13 7部分工艺计算----------------------------------------15 8三废处理--------------------------------------------17 9参考文献---------------------------------------------18
一. 前言 L-色氨酸是种重要的氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料等行业。近年来,各行业对L-色氨酸的需求量日益增加,而现有产量远不能满足国内外市场的需求。因此,开发微生物酶法生产L-色氨酸的工艺路线具有广阔的应用前景。 目前我国市场上销售的[色氨酸主要依靠进口，我国国务院已于2004、 2007年将I 色氨酸生产列入"鼓励外商投资产业目录"之中。直接发酵法生产[色氨酸的研究，对发展我国氨基酸发酵工业具有重大的意义。本文对发酵液中色氨酸的快速测定、出发菌株的生理特征和产酸特性、I 色氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化进行了重点研究。 1.1色氨酸的理化性质 色氨酸属于中性芳香族氨基酸，结构中含有吲哚基，在生物体中，色氨酸以结 合态或游离态存在。其结构式如图1-1所示：色氨酸是手性化合物，有[型和0型两种镜像结构。[色氨酸是人体必须氨基酸，它参与人体与动物的蛋白质合成和代谢网络调节，并广泛的存在于自然界中； 0-色氨酸不能合成蛋白质，在人体内几乎不发生代谢作用。 L-色氨酸化学名为L-2-氨基-3-吲哚基丙酸，别名为L-氨基吲哚丙酸、胰化蛋白氨基酸。其分子式为C 11H 12O 2N 2，相对分子量为204.21，熔点为289℃，等电点PI 为5.89， pKa （25℃）为2.38及9.39， 微苦、呈绢丝光泽六角片状白色结晶，在水中溶解度1.147％ （25℃）2.80％（75℃）, 微溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿，在碱液中稳定，在强酸中易分解。 1.2 L-色氨酸的用途 L-色氨酸在生物体内不能自然合成，需要从食物中摄取，是动物和一些真菌生命活动中的必须氨基酸。L-色氨酸在蛋白质中含量很低，平均含量约1％或更少。L-色氨酸能调节蛋白质的合成、调节免疫及消化功能，增加 5-羟色胺代谢作用以图1-1色氨酸的结构式
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/ac13361284.html, 透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况 作者：李萌季永甜等 来源：《湖北农业科学》2013年第13期 摘要：透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的高分子黏多糖，广泛地存在于动物组织中，具有独特的生理特性，在许多领域得到广泛的应用。目前，透明质酸的生产方法主要有提取法、微生物发酵法和人工合成法。对微生物发酵法进行了概述，对透明质酸在化妆品、保健品和医学医疗领域的应用进行了简要介绍，并对透明质酸的生产和应用前景进行了展望。 关键词：透明质酸；微生物发酵法；育种 中图分类号：Q538；TQ920 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-2980-04 透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是1934年Meyer等从牛眼玻璃体中提取分离得到的一种大分子多糖，故又名玻璃酸[1]。透明质酸是由2 000～25 000个通过β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替地结合在一起的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的均匀重复的线性葡糖胺聚糖[2]。 透明质酸是胞外基质（Extracellular matrix， ECM）的重要组成部分[1]。近来的研究表明，透明质酸不仅广泛存在于细胞间的胞外基质中，还存在于细胞内，主要集中分布在新生细胞的胞浆和细胞核中[2]。除了在玻璃体中外，透明质酸在关节滑液和表皮细胞间隙中的含量 也十分丰富，从数量上看，50%以上的透明质酸存在于皮肤的真皮和表皮中，约35%存在于肌肉和骨骼中。目前认为透明质酸主要是存在于软结缔组织中的惰性空间填料中，在组建蛋白多糖复合物的过程中起着重要的作用[2]。 1 透明质酸的性质 在电子显微镜下，观察到透明质酸分子呈线性单链结构，并在水溶液中扩展成随机的线圈状结构，线圈的直径约为500 nm。透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条 件下均可解离，形成阴离子，等空间距离阴离子之间的相互排斥使其分子在水溶液中处于松散的扩展状态，占据了大量空间，故可结合多于本身1 000倍的水[3]。 根据透明质酸的来源和提取方法的不同，其相对分子质量（Mr）为8×105～5×106[4]。透明质酸的结构及生物活性具有相对分子质量依赖性，其中低相对分子质量透明质酸在低浓度时仅生成碎片状网状结构，而高相对分子质量透明质酸却能生成整体的网状结构[3]。 由于分子内存在氢键，透明质酸分子在水溶液中呈现单螺旋结构[5]。当透明质酸在溶液 中达到一定的浓度时，透明质酸分子间便会产生相互作用，从而形成双螺旋结构，浓度更高时则会形成网状结构[3]。目前公认的透明质酸结构理论是三级结构理论，即透明质酸分子中每
药物分离与纯化
硕士学位课程考试试卷 考试科目：天然药物的分离与纯化 考生姓名：邱诗春 考生学号：20111902042 学院：生物工程学院 专业：生物学 考生成绩： 任课老师(签名) 考试日期：20 11 年11 月 5 日午时至时
姜黄中天然药物的分离与纯化 摘要：姜黄素是姜黄属植物中的主要活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用，有较好的临床应用价值和研发潜力。随着提取分离纯化技术的发展，目前有多种方法从植物中提取并分离姜黄素。本文对近年来研究姜黄素的酶法、渗漉法、水杨酸钠法、超临界CO2 萃取法、超声提取法及微波提取法等提取方法；大孔树脂吸附法、聚酰胺吸附法、活性炭色谱法、硅胶柱色谱法、乙酸沉淀法等分离纯化方法进行综述，为进一步开发利用姜黄素提供依据。 关键字：姜黄素；提取；分离 Abstract: Curcumin is one of the major active ingredients in plants of Curcuma L. and has many pharmacological effects, such as: anti-cancer, anti-oxidant, anti-inflammatory, free radical scavenging, and anti-microbial effect in the cardiovascular system and digestive system, and so on. It has better clinical application and developping potential of new drug. With the development of extraction and isolation technology, there are many ways to extract and isolate curcumin from plants. The recent studies of curcumin extraction methods, i.e. enzyme method, percolation method, sodium salicylate method, supercritical CO2, ultrasonic extraction and microwave extraction. Separation methods, i.e. polyamide adsorption, macroporous resin adsorption, polyamide adsorption, activated carbon chromatography, silica gel column chromatography and acid-precipitation method are reviewed to provide the basis evidence for further utilization of curcumin. Key words：curcumin; extraction; separation 姜黄（Curcuma longa）为多年生草本植物，其性味辛、苦、温，入心、肝、脾经，可行气破瘀，通经止痛，并且还有助消化特性，可以作为调味品、天然色素、天然染料，近年来因其具抗肿瘤、抗炎、抗氧化[1,2]等活性而倍受关注．姜
基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化
基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化 时间：2005-5-17 10:56:24 作者：不详来源：中国发酵工业网点击数： 本站另注：L-苯丙氨酸已在国内江苏部分厂家有发酵工业规模化生产，但仍然推荐此文供大家研究参考，了解工艺配方和分析方法。 L-苯丙氨酸(L-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。L-phe在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。而且,L-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料。同时,L-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。在食品工业中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。基于L-phe广泛的应用前景,近年来L-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。目前,L-phe的生产方法有酶法、发酵法等,直接发酵法具有可利用廉价原料直接生产L-phe的优点,发酵法生产 L-phe,国外报道产酸率为2.8%,L-phe在我国还未实现规模生产[2]。本实验对构建的重组L-phe基因工程菌 E.coLiHB101. 进行发酵实验,研究了其发酵工艺条件及营养物质的流加对产物L-phe积累的影响。 1实验材料与方法 1.1发酵用菌株基因重组工程菌E.coLiHB101. 。 1.2培养基 1.2.1种子培养基蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。 1.2.2发酵培养基Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamat e0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖 20g/L;Km40mg/L。 1.2.3补料培养基CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。 1.3培养方法1.3.1摇瓶培养250mL锥形瓶内装LB培养基25mL,接种菌种斜面后,于旋转摇床上,在37℃培养12h。 1.3.2深层培养 在2L自控发酵罐(美国进口)中装入1L发酵培养基。灭菌后接入5%的摇瓶种子。通气量为1000L/L·min时,于38.5℃下搅拌培养。搅拌转速根据溶氧(DO)调节;使用28%的氨水调节pH=7.0±0.2;采用流加葡萄糖工艺补料,补料速率由测定葡萄糖来控制。 1.4测定方法 1.4.1菌体浓度 通过测定培养液或其稀释液在波长660nm处的吸光度OD660确定菌体浓度。一个OD660单位相当于 0.267g/L(菌体干重)。当OD660<0.3时,有良好的线性关系。 1.4.2残糖浓度 用费林试剂法测定[3]。 1.4.3发酵液中L-phe浓度分析 用荧光法进行测定[4]。 2结果与讨论 2.1生长因子对苯丙氨酸积累的影响 通过添加不同浓度的酪氨酸,实验由图1示出:随着酪氨酸添加量的增加,产酸率提高,从发酵成本和产酸率两方面分析,得出酪氨酸的最适添加量为1.0～1.2g/L,既可得高产酸率3.68%,又可使成本不致过高。