发酵法制备透明质酸的研究进展

源能提供不同的生长因子进行疆补，事Ｊ于细胞生长．奖明麓１１９Ｉ在ＵＶＤ．３４透明质睃产生菌的发酵培养基中 添加复合囱．桃氰源ｆｍ（虽良陈）：ｍ（酵母膏）：ｍ（牛肉罾声ｌ：Ｉ：ｌ】．ＨＡ的产置可达４．５９，Ｌ。安海平等ｌ驯发 现．餐臼胨是马疫链球菌Ｎ２５０６最好的氰源。丽商海军等｝１７】发现酵母粉是兽疫链球ｉ滴Ｈ２３最好的簸源．这 可能是因为随种不同，其最佳氮源也不同。
物来源麴致ｊ南璃邀污染豹冠狳．所产ＨＡ白－型籀的产缀和分子鼹等傀点，因此微生物发酵法生产融逐步取
代传统的从动物组织中提取ＨＡ的方法成为制蔷ＨＡ的警要方法［６１． 发酵法生产透明质酸并挠淼箕产量和控制毵分子量的研究内容主要有：菌株筛选，发酵条件优化积分
作者简介：熊越（１９８５－）。鹦，研究饿，燕璺研究力－辩为食赫徽饿钫孥
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｎ
Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＸＩＯＮＧ Ｙｕｅ，ＨＥ Ｚｈｉｆｅｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｍｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７ １ ５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｉｍｅｄ ａｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓ仃ａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ弘Ｄ∞ｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｅ ａｃｉｄ
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发酵法制备透明质酸的研究进展
熊越
贺稚非
（西潦大学食品科学学院，重庆４００７１５）
摘要：对笈酵滋制备透明质酸的攘种选育．工．芑傀化等方面的研究进艇连行了综述，重点讨论了强度，ｐＨ值、 揽拌转遂，发辨时问以及培养方式等发醛拳件对透嚼质酸产蟹耜分予量的影响，并对发酵竣生产透明质醴的发震 前景进行了展鞠，馋在为发酵弦嚷产透明质陵的发酵条件的嗣ｆ究搀供参考和借壤． 关键调ｔ透ｌｉＩ！ｌ魇艘；发酵；蔚疫链球莳
离纯化。优良的荫种是发酵法生产透明质酸的基础．当菌种确定焉，发酵条件成为影响ＨＡ的产童和分子 量的枣要冈素。因此。优化培养基和发酵条件是发酵法生产ＨＡ的关键步骤。本文对蔺种选育、培养基的 营养条件及发酵工艺的优化进行了综述，以期能指导透明质酸的发酵生产．
１菌种选育
高产ＨＡ麓种的选育是提菇发酵法生产ＨＡ产量的先决条件，产透明质酸的蔼种主要是链球菌属的Ａ群 和Ｃ群。Ａ群主要是酿脓链球菌等。由于Ａ群致病性较强．较少使用．放多采用致病性较弱的Ｃ群，主要肖
株无溶阻性藤株ＮＣＩ １５０．并在此基础上继续ｆ｝ｌ够ｃｏ吖射线辐照诱变樽到产篮较高的菌株ＮＣｌ６８，使透明质 黢产量与出发蒲株ＮＣＩ １５０相比提商７ １０１％。２００９年．邓静ｌｌ２Ｊ蒋人比较了紫外、硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、微 波、温度等不同诱变方法攀独和复合诱燮对兽痰链球灞产透明质酸的影响，发现复合诱蹙比单一诱变效果 好．丽摄优条件。Ｆ得别的蔼株的ＨＡ产量捆对予ｊ霹ｉ始鞘株增加了７２％。
ＯｌＡ）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｂｙ
ｆｅｒｍ髓ｔａｔｉｏｎ
ｗ馓ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ
ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ．
Ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ａｇｉｔａｔｉｏｎ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
Ｙｌ诩Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ［婚Ｉ报道了将
Ｉｌ研等人在马疫链球黼豹生物反应器中。加入５０扎的蔗糖．１０玑酪蛋白承解物．经ＪＳｔ２４．－－２８ｈ后，产出５－－６８
约ＨＡ，ＨＡ的到收率怂蔽终物质的６５％。分子匿为４ｘ ＩＯ％。
生产ｌ认的培莽蔟巾常用的氮源为蛋白胨，簿母裔绒授出粉、牛肉浸膏等的复含氮源。因为复配豹瓴
ｉ：｝ｉ ｌ株溶斑鬃和透明质酸酶双缺陷型掰产ＨＡ的突变请株ＦＪ－２３．使ＨＡ产璧提裔５倍。魏甲乾ｉｌｏｉ等人利掰重离
子和紫外线辐照诱变相结合的方法对耪疫链球麓Ｃｙ‘’ｃ１９１７进行７诱变处理。获得ｌ橡产ＨＡ能力提商３僻多
的高产透明质酸菌株Ｈ－７。缸痢大学的陈永浩等人ｌｌｌＪ以通过紫外线和弋。吖射线辐照诱变码链球菌。碍剜～
３发酵条件
发酵条件是影响ＨＡ产量和分子盈的荚键因鬃．适宜的发酵条件不仅有利予菌体的生长．砸且可以提 离微生物台成产物的能力．下晒分别就发酵条件（温发、ｐＨ值，转速，发酵时问、培养方式翻漆加捌簿）对 ＨＡ的产鼍和分子墨的彩响进行综述。
３．１温度对ＨＡ产量和分予璧的影响
溢艘髓影响微生物机体内酶的沂性、细胞质腔｝ｌ勺流动性以及物质的溶解缱，因ｉｉｉｉｉ温度豹变化会对微生 物的牛长和代谢过程产簪影响１２ ｎ］．一般来说荫种的域适嗽长潺度与最适产酸温度不一致，所以在不同的阶 段往往采用不同的温度，在种子培养阶段和发酵的初期．３７℃培养可使篱体较恢的生长繁殖。发酵中后明 瓤适当改变温度．搬撒通通过变温可搜镯萄镛的代谢方向囱合成蘸体细胞缀转向合成ＨＡ，从而可以提高 产率。通过考察翁种的生长曲线对ＨＡ的影响。初步确定分阶段控温董艺．可鸯ＥＨＡ产量有一定程度豹提高． Ｋｉｍｌ＝！认为对于马链球落ＫＦＣＣｌ０８３０。３７＇Ｃ时。ＨＡ的分子赞町达翻３．窖ｘ１０｛６ Ｕ。Ａｒｍｓｔｒｏｎ９１２３ｌ簿发现，温 度商予域低予３７℃时，ＨＡ的产量和分子熬挪会下降。另外许多研究者认为目前用予生产ＨＡ的链球耩大多
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＡ
ｆ孤ｅｎ枷明．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ７Ｊ的ｐｉｄｅｍｉｃｕｓ
透明质黢《ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉ也ＨＡ）是由Ｄ－葡萄撼醛酸和Ｄ童“Ｚ。鬣氮毖葡籀耱的双糖筚位以肛１１３和争ｌ＇４ 糖嚣键反复交赣连接蜥成鹇链状商分子酸性黏多糖。因为其最早由Ｍｅｙｅｒ和Ｐａｌｍｅｒ在１９３４年从牛隈玻璃 体巾分离得到，所以又名玻璃隈【ｌ】。ＨＡ分子中的羧基和极性基丽可与承形成氧键，从而可以吸收与保持 自身体霆千倍以上的水分，是嘲际上公认的离黼质｛｜ｉｉ｝湿钠。由予其独特的生物适应性，豢水性和黏弹性，． 透明质酸被成用予促迸伤口愈合【２Ｉ，治疗骨关节炎【３】张傲药物裁体【４】。在化妆晶和食品原料中ｆ５】。ＨＡ的 斑用也很广泛。通常，低分子擞的｝执用作食品原辩，中等分子爱的｝执用于化妆赫，而高分子麓的ＨＡ在 睚擘｝：使用较多． ｝纸广泛存在予动物的各种组织闻质中，如皮肤、脐带、眼玻璃体、鸡冠、荚节滑渡、软骨、卵细胞 鄯雁Ｌ镑髓等，其巾以人脐带、鸡冠、关节滑液和玻璃体含擞较崧。传统的｝ｌＡ提取方法就链１２置这些动物组 织为联辩进行提取。但这照动物组织来源圈罐、价格昂贵、：：：Ｉ＝艺复杂、产品得韶ｌ瓯魏耪制嘲娥。而微生物 发酵法与动物缎纵提取法榴比．具钉原料不受限制．勃≯分勰纯化，成本低，易于形贼规模化生产。晃动
时，ＨＡ的分子援随转速的升蕊望现先增后酶的趋势。知ｍｇ虹∞ｆ硼将搅拌速度从３０帖Ｉｏｏｏ疗ｒａｉｎ进行变化，
ＨＡ豹分子蟹簇本没有改燮。
３．４发酵时闻对ＨＡ产量和分子量的影响
发酵避稷中选择合适盼培养时阀对整个发酵工艺不仅节省了时闯，而毽降低了发酵成本。冯建成Ｉ硎 认为，码疫链球蔺ＳＩ－Ｉ－２程疑酵轴精明进入对数期．菌体慧与ＨＡ的产鬣嘲步急铡增长，在４４ｈ时ＨＡ的产基
数怒来自呐乳动物体内的细蒲，因此，甏程体外培养啦产匿多的姒，需提供袋儆悔内生长的人王培弊环
境，其生长适宜激度与宿主体温３７１ｃ相近。
３．２
ｐＨｌ暄嘲。ＨＡ产量和分子量的影响
链球麓是～种乳黢蒴。产生乳毅、乙酸等小分子有机璇．发酵过穰巾需要用碱液进行中和玖维持适当
的ｐＨ值。报错Ｍｉｃｈａｅｌｌ２４１等人的研究，ｐＨ蔓ｊ６．７如．２时．ＨＡ产璺最商．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ［２剐等人也认为ｐＨ对ＨＡ的 产率和产璺彩晌较大，在ｐＨ为６．７时．最有利于兽疫链球翁生产ＨＡ，ｉ峨＇Ｈ对ＨＡ的分子篮基本ｊ墼肖彩响． 罗瑙明１２ｊ１认为ｐＨ值对龋体合成ＨＡ和乳陵有不同的影响．ｐｈｉ９７．５时最迂予细胞生长，也最适予ＨＡ的合成。 葡萄精消耗也鳢彻底，弧ｐＨ镪巍０：８时对乳酸台成有利。
＆即协删缈嘲觎嚣豹ＨＡ产生纂因ｓ曲ａ蚺导入煎缀足∞疗中，得到了分子跫３．５ｘｌ旷列１．９ｘＩ旷Ｄ荔的ＨＡ，显
示了熏组尼瑚作为ＨＡ生产落的潜力。
２培养基组分
良好盼培葬基是微牛物发黪的基础，帑养基的舷质对发静孛产起蕾楚关重要的作用。难产ＨＡ发酵的 培养纂一般包括碳源、氯源、无机盐、维生素， 其次为蔗糖和麦芽精．这是因为绝大多数微生物对单槠的利用速度委比双错和多搪快．Ｖｉｄｈｙａ Ｒａｎｇａｓｗ硼ｙ
０１１
ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌ越ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＨＡ ｗｅｒｅ ｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ＨＡ
ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｃⅨｌｕｃｔｉＯｎ ｂｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ。ｉｎｔｅｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
鲧生质体诱变使用豹诱变剂避常有物理和化学２大类．滕利荣１１３嗨发现，经过激光诱赍后，蒋疫链球
菌的鲧生质体存活的菌株｝认产率绝犬部分都有所提高，这为发醉法生产ＨＡ提供了一种获褥高产馥椿的新 途径。 随菥龠成ＨＡ关键酶旗闼的克降，构建旗因工释翁成为提高产量并挖翩分予璧的研究热点。与体统发 酵撼棚比．錾囡ｊＩ：程荫难产ＨＡ的貔势耋蟹钉：（１）何提商｝ＩＡ产燕；（２）不产生对人体有密豹物质｛《３）＋卜游 分离过程糨ｊｃ雪简化。嘲内外学者对透明质陵台成酶的空间雅掏和能化性能进行了犬缀研兜，取得了一熙进 怒．织尚有许多未麓之谜。与阉外棚比，隔内在分予机制研究也起步较娩，ｌ；；Ｉ新生要蓿力予提离ＨＡ发酵 产量。提高ＨＡ产量和分子量的策略源自多项肇础研究的成果。单一手段难予达到磁镌效粜【ｌ棚。郝宁［１５ｌ等 将兽疫链球藏ＨＡ的合成纂因ｈａｓＡＢＣ以及合成透明颧荫赢缎蛋白的ｖｇｂ蒸因插入网性荫寝达质牧ｐＥＵ３０８ 中．遴过电转化导入兽痰链球蒴中．得到了透明颇陵血红蛋臼豹袭达。使ＨＡ产量增加３１％。此法生产的 ＨＡ有相对分子质量相对均一、分数性小孵特点。Ｈｕｉｍｉｎ
３．３搅拌转速对ＨＡ产量和分予量的影啊
搅捧可以强化气．渡闯辍的传递，维持发酵液中有足够的溶氡，叉可使发酵液巾的备营养成分混合均匀． 有利于细胞豹吸收和剃崩，其转速疑影礁发簿液游氧浓度豹荚键因素之一．Ｗｅｉ－Ｃｈｉｈ Ｈｕ糊一嘲等建议格溶 氧浓度控制在瞧界值以上，而搅动条件尽蹩温和。战後等１２７ｌ则认为在发辩时期采耀较低的搅拌转速 （２００ｒ／ｒａｉｎ），使馥体细脆戆快速生长，发酵开始ｌｏｈ质适警提高搅捧转速（３５０ ｒ／ｒａｉｎ）－－方丽町通过降低落体 的生长速率来降低乳酸的积累盛；另一方面由于此时缎酵液报黏稠，捉角搅肄转速可以促进混台，有利于 ＨＡ发酵的进行。华东理工大学的杨利１２Ｓｌ等人报道了控饿搅拌条件～致时．在厌氧条件下ＨＡ的分予餐较低． 随溶辘水平豹增棚分子摄逐新增翮，织翔溶氧水平越过５０％髓，分子擞出现Ｆ降．当溶瓴水平控制在５０％
明质艘），且ＨＡ发酵产率低．为了解决透明质酸酶和乡｝毒索污染的问题。日本的Ｎａｏｋｉ［ｚａｗａｌ７１等人从传统
要想克服菌种的不利因索，得到发酵产率较高的茵种，一般都要经过诱变缝理。目前翁种的选育方式 有诱变荆霄种．原生质体育种和基因工程育种。现阶段应用最多的还楚诱变剂（主要是紫外线、丫射线、飘℃ｏ 和ｌ、ｒｒＧ）育种潮。冯建成等１９ｊ以马疫链球菌ＳＨ－Ｏ为出发落，利用繁外诱变和ＮＴＧ诱变的复合诱变方法造留
蛰疫链球萄故翻唧粕∞钾鄹∞Ｄ嘞缸缸掰缸蝴、码链球蘸（Ｓｔｒｅｇｔｏｃｏｃ粼ｅｑｕＯ和类马链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｍ ｅｑｍｓ．ｖ，）
簿。达魑现有的滚种大多数酃产溶血索（溶躺红细胞，杀死自细胞翩褥密心腱）和产透明顼艘酶（分解透
乳涮晶巾分离晰一株ＨＡ的高产荫株＆倒嘞删￥棚叩蒯妇，弗对其进行了签定。