药物体外肝代谢研究进展

广义的药物代谢指药物在体内吸收、分布、生物转化、排泄等一系列过程。狭义的药物代谢指药物的生物转化。生物转化后，药物的理化性质发生变化，从而引起其药理和毒理改变。因此，研究药物的生物转化，明确其代谢途径，对制定合理的临床用药方案、剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。当前，国内外对药物代谢研究主要集中在代谢产物生成和确定代谢途径方面。在分子生物学技术推动下，药物代谢酶领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极意义，已得到广泛重视。体外代谢研究可以排除体内因素干扰，直接观察酶对底物的选择代谢性，为整体试验提供可靠的理论依据。因此，对于体内代谢转化率低、毒性大及缺乏灵敏检测手段的药物来说，体外代谢研究成为良好的研究手段。肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生[1]。以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。

1肝微粒体体外温孵法及基因重组P450酶系法1.1肝微粒体体外温孵法

肝微粒体体外温孵法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。

1.1.1细胞色素P450及其亚型细胞色素P450（CYP450S ）是肝微粒体混合功能氧化酶系的主要成分，是一组由许多同工酶组成的超基因大家族，涉及大多数药物代谢的P450酶系，主要有CYP1、CYP2、CYP33个家族。根据代谢转化的特点，可有目的地进行诱导，影响其酶的亚型，使其对底物的代谢选择性更强、

转化率更高[2]。不同的诱导剂及抑制剂诱导或抑制不同的P450酶亚型。1.1.2运用肝微粒体体外温孵法进行药物体外代谢途径研究运用肝微粒体及NADP +与异枸橼酸还原酶系再生NADPH 系统能够进行药物体外代谢途径的研究，Alison 等[3]对Tegaserod （一种选择性的52HT4受体）的体外代谢途径研究结果表明，O 2去甲基的Tegaserod 是其在肝微粒体代谢中的主要产物；而应用人肝组织切片及小肠组织切片中对该药物代谢途径进行了研究，通过LC2MS 的检测分析，N 2葡萄糖醛酸化的Tegaserod 为其主要的代谢产物，O 2去甲基的Tegaserod 未检出。说明肝微粒体与肝组织切片中代谢酶系的组成存在差异，对应于催化不同的代谢途径，哪一种体外代谢途径更接近于体内情况仍需进一步研究。

1.1.3运用肝微粒体体外温孵法预测药物体内代谢清除研究目前肝微粒体体外温孵法被越来越多地用来预测药物在体内的代谢清除，一般通过测定药物体外代谢酶促动力学获得Vmax 及Km （米氏常数），运用合理的药动学模型来推断体内药物的代谢清除。Alexander 等[4]运用大鼠肝微粒体体外温孵法研究了CP2199，331（一种LT1受体的拮抗剂，应用于哮喘的治疗）的动力学参数（Vmax 和Km ），推算出CP2199，331肝脏清除率分别为雄性大鼠64mL ·min -1·kg -1，雌性大鼠

2.5mL ·min -1·kg -1。该结果表明，CP2199，331在体外大鼠肝微粒体温孵组成中发生氧化作用时，雄性大鼠比雌性大鼠表现出较强的亲和性，这一结果与雄性、雌性大鼠中分别静注给药所测的血浆清除率是一致的。体外预测的肝脏清除率与体内检测的血浆清除率具有显著相关性，说明CP2199，331的清除完全是由肝脏代谢完成的。肝微粒体体外温孵法较其他体外肝代谢方法而言，其酶制备技术简单，

卫生职业教育临床实践药物体外肝代谢研究进展

陈涵，王琳，张伟

（甘肃省康复中心医院，甘肃兰州730000）

摘要：目的介绍药物体外肝代谢方法的最新研究进展。方法根据近几年的文献资料进行分析、综合、归纳。分别按照肝微粒体体外温孵法及基因重组P450酶系法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法及器官组织切片法进行介绍。结果药物体外代谢酶系的研究是药物体外肝代谢的研究热点。结论药物体外肝代谢的研究对新药研究与开发、正确指导临床合理用药具有巨大的推动作用。

关键词：体外肝代谢；肝微粒体体外温孵法；基因重组P450酶系法；离体肝灌流法；器官组织切片法；肝细胞体外温孵法中图分类号：R969.1

文献标识码：A

文章编号：1671-1246（2009）21-0138-03

Vol．272009No．21

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代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面进行研究，因而在实际工作中应用较多。但肝微粒体体外温孵法同其他体外肝代谢方法相比，与体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果是否可用于预测体内情况仍需进一步证实。

1.2基因重组P450酶系法

基因重组P450酶系法即利用基因工程及细胞工程，将调控P450酶表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，经细胞培养，表达高水平的P450，纯化后可获得较纯的单一P450同工酶的体系。

1.2.1运用基因重组P450酶系法确定诱导药物代谢的P450酶亚型的研究Ring等[5]运用基因重组人肝中9种P450酶亚型研究了诱导药物Atomoxetine4位羟基化反应的P450酶亚型，结果表明，CYP2D6诱导速率为其他亚型的475倍，当CYP2D6浓度较低时，其他P450酶亚型也可进行低效诱导。因而，临床合并用药时如有CYP2D6的抑制剂，也不能完全预测Atomoxe－tine体内清除被抑制。Amato等[6]运用基因重组人肝中P450酶亚型研究N，N2二甲基甲酰胺（DMF）和N，N2二乙基甲酰胺（2种肝毒性溶剂）的代谢，结果表明，DMF的代谢只被CYP2E1诱导，而DEF可被CYP2E1、CYP2C10和CYP3A4诱导，因而在DMF的代谢中，CYP2E1的表达至关重要，不同个体间CYP2E1表达的差异决定了个体间对DMF耐受的差异。

1.2.2运用基因重组P450酶系法对P450酶亚型的特异抑制剂的研究Hisashi等[7]运用基因重组CYP2C19及一系列相关的P450酶亚型研究发现：（+）2N232苄基252苯基252乙基海因和（-）2N232苄基2苯巴比妥为2种新的强选择性的体外CYP2C19抑制剂，在单一底物浓度下，0.3μmol的（-）2N232苄基2苯巴比妥和1.0μmol的（+）2N232苄基252苯基252乙基海因对各种C2DNA表达的CYP1A2、CYP2A6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等的活性降低均未超过16%，而CYP2C19的活性在同样的条件下被抑制80%。因而，这2种化合物可在药物代谢研究的早期筛选中得到应用。基因重组P450酶系促进了对人P450酶系功能和特异性的研究，使其被更多地应用于药物的高通量筛选方面。

1.2.3运用基因重组P450酶系法对药物间相互作用的研究Zhang 等[8]利用基因重组在药物代谢中发挥主要作用的8种P450酶亚型，在体外评估了5种抗真菌药物对其特异性和选择性，结果表明，在20～200μmol·L-1的浓度范围内，CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、CYP3A4均被克霉唑、咪康唑、硫康唑、噻康唑4种药物所抑制；而酮康唑更加特异性地抑制CYP3A4，抑制率几乎为100%。因而推测这类药物在体内很可能具有明显的药物之间的相互作用。另外，基因重组P450酶系亦可预测人体内药物氧化代谢的多态性[9]。基因重组P450酶系因其具有分子水平的优势在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。适合研究药物代谢领域微观化和细节化的问题，其结果的具体性和科学性更强，更有利于指导相关领域的工作。但其实验成本较高，制约了这一方法的广泛应用。

2肝细胞体外温孵法

肝细胞体外温孵法同肝微粒体体外温孵法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，该方法被广泛用于评估药物代谢过程中药物间的相互作用。但肝细胞制备技术较复杂，目前以胶原酶灌注技术为主[10]。且体外肝细胞活性仅能维持4h，不利于储存和反复使用。

2.1运用肝细胞体外温孵法进行药物体外代谢途径研究

Nakagawa等[11]制备新鲜大鼠肝细胞研究BPA[2，22双（42羟基苯基）丙烷]的体外代谢行为。用胶原酶灌注技术分离肝细胞，肝细胞存活率>85%，混悬于Krebs2Henseleit缓冲液（106 cells·mL-1），pH值为7.4，加入12.5mmol·L-1HEPES和0.1%蛋白，温孵于37℃，持续通入湿润的95%O2、5%CO2体系中，反应在加入BPA的二甲基亚砜（DMSO）溶液（最终浓度<0.1%）后开始。对照组加入同体积的DMSO，反应中定时从温孵体系中取样以监测细胞的活性、BPA浓度及其代谢产物。经过2h的温孵，HPLC2MS或GC2MS检测结果显示几乎所有的BPA（0.25 mmol）很快代谢为BPA的单葡萄糖醛酸结合物（约占总代谢产物的75%），及2个次要代谢物（BPA的单硫酸结合物和32OH2BPA）。在BPA体内代谢研究中发现，大鼠灌胃给药，约20%～30%的BPA从尿中排泄，主要为首过效应中生成的BPA 葡萄糖醛酸结合物，其中硫酸结合物占尿液中总代谢物的2%～3%[12]。因此，BPA肝细胞体外温孵与体内过程很相似，具有一定的代表性。

2.2运用肝细胞体外温孵法进行药物代谢体外清除研究

Yoshihiro等[13]运用分离的大鼠肝细胞混悬于大鼠血浆的体外温孵法，考察了16种化合物的体外肝清除率，其结果与同样化合物的体内血浆清除率具有较好的一致性。同常规的肝细胞体外温孵法相比，该方法实验周期短、效率高，可用于药物开发的早期代谢筛选。

2.3肝细胞体外活性维持的研究

由于肝细胞活性体外维持时间短，减少新鲜肝组织的消耗（尤其是目前人肝细胞的应用越来越普及），维持肝细胞的活性显得十分重要。Hengstler等[14]研究优化肝细胞冷冻技术，同新鲜肝细胞相比经过该技术冷冻储藏的肝细胞，其活性为新鲜肝细胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性> 60%，因而该冷冻的肝细胞可用于温孵时间不超过8h的代谢研究，亦可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一步优化。肝细胞体外温孵法同肝微粒体体外温孵法相比，在代谢物生成、体外代谢清除等研究方面有许多相似性，但针对具体药物在代谢物种类、生成主要代谢物及所反映的药物代谢特性上存在着程度不同的质或量的差异。在药物代谢酶诱导研究中，肝细胞体外温孵法占主导地位，且随着肝细胞冷冻技术的发展，因其体外活性维持时间短而造成应用受限的状况也会不断得到改善。

3离体肝灌流法及器官组织切片法

3.1离体肝灌流法

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