【CN109666745A】染色体1p19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910117207.X

(22)申请日 2019.02.15

(71)申请人 领星生物科技（上海）有限公司

地址 201203 上海市浦东新区中国（上海）

自由贸易试验区祥科路111号腾飞科

技楼2号楼5楼

申请人 上海领安生物科技有限公司　

启东领星医学检验所有限公司

(72)发明人 魏金旺　张敖　王晨　戴春　许强　

(74)专利代理机构 上海市汇业律师事务所

31325

代理人 陆红杰

(51)Int.Cl.

C12Q 1/6886(2018.01)

C12Q 1/6806(2018.01)

C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称

染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法

及试剂盒

(57)摘要

本发明公开了一种染色体1p/19q联合杂合

性缺失的检测方法，步骤包括：

1）在1p和19q上选择相同数量的SNP位点；2）设计原始引物，将每条

原始引物最靠近3’端但非末尾的T修改为U，若3’

端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获

得多重扩增引物序列；3）合成多重扩增引物并溶

解混合；4）多重PCR扩增；5）处理扩增产物，使U的

单链形成一AP位点，再暴露出AP位点的5’磷酸和

3’磷酸末端；6）测序，根据SNP等位型频率判断该

染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。本发明

基于多重扩增子的NGS方法检测Chr1p/19q co -

LOH，不仅检测灵敏度、特异性和效率高，而且对

样本限制小。权利要求书2页 说明书10页序列表13页 附图2页CN 109666745 A 2019.04.23

C N 109666745

A

权　利　要　求　书1/2页CN 109666745 A

1.染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：

1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；

2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；

3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；

4）进行多重PCR扩增反应；

5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；

6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1），一部分SNP选自1p36.3区段和19q1

3.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，且该SNP在基因组中的距离大于300kb。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1），1p和19q上各选择10个SNP位点，其中，1p 上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP 位于19q13.3区段。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述原始引物的序列如SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:80所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4），PCR反应体系包括：2×Platinum Multiplex PCR Master Mix 15µl，80µM多重扩增混合引物 10µl，1ng/µl样本DNA 5µl，总体积30µl；PCR反应条件：95℃ 2min；95℃ 30s，60℃ 90s，72℃ 20s，30个循环；72℃ 10min；4℃保持。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5），在产生5’磷酸末端和3’磷酸末端后，还包括有如下步骤：使用T7核酸内切酶Ⅰ切断暴露的单核苷酸单链，将原始U往5’方向的序列全部切掉。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5），反应体系包括：无核酸酶超纯水4.3µl，部分消化反应缓冲液2.2µl，尿嘧啶DNA糖基化酶0.5µl，核酸内切酶Ⅷ 0.5µl，T7核酸内切酶Ⅰ0.5µl，多重扩增产物14µl，总体积22µl；反应条件：37℃ 20分钟，10℃ ≤1小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5），所述部分消化反应缓冲液的组成成分为：500mM乙酸钾，150mM Tris-乙酸，100mM 乙酸镁，1g/ml BSA，用乙酸调至pH 7.9，25℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6），判断方法包括如下步骤：

61）将测序结果与hg19序列比对，获得所有SNP的等位型频率；

62）识别杂合型SNP；

63）如果杂合型SNP两个基因型的比例在45%～55%之间，则判定该SNP未发生联合杂合性缺失，否则认为该位置发生了联合杂合性缺失；

64）如果染色体臂上任意一个杂合型SNP被判断为发生了联合杂合性缺失，则判定该位点所处染色体臂发生了联合杂合性缺失；

65）当1p和19q均发生了联合杂合性缺失时，判断为该染色体发生了1p/19q联合杂合性

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