土壤微生物生物量的测定(滴定法)

土壤微生物生物量(碳、氮）的测定(滴定法)
一、实验目的和内容
土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。

耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。

近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。

目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。

氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。

二、实验材料和用具
仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）
试剂：
1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。

方法为：量取500ml氯仿于1000ml 分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；
3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；
4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；
5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。

此溶液不稳定，需标定其浓度。

6.硫酸亚铁溶液浓度的标定：吸取重铬酸钾标准溶液（试剂3）10.00ml放入100ml三角瓶中，加水约20ml，加浓硫酸3～5ml和邻啡罗啉指示剂2～3滴，用FeSO4溶液滴定，根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。

三、操作步骤
1．采样与样品预处理
土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。

采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物（如蚯蚓）等，然后尽快过筛（2～3mm），或放在低温下（2～4℃）保存。

如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。

过筛的土壤样品调节到40％左右的田间持水量，在室温下放在密闭的装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个适中的烧杯，分别加入水和稀NaOH溶液，以保持其湿度和吸收释放的CO2。

预培养后的土壤最后立即分析，也可放在低温下（2～4℃）保存。

2．熏蒸
在低温下保存的土壤要先从冰箱中取出，待放置到室温时再进行分析。

称取10g过2mm筛的新鲜土样置于100 ml 塑料瓶中，放入真空干燥器内，并在真空干燥器内放置一装
有去乙醇氯仿的小烧杯，烧杯内可放置几片防爆沸的干净小玻璃珠。

同时放入一小烧杯稀氢氧化钠溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，还应放一装水的小烧杯（或在干燥器底部放一层湿滤纸）以保持湿度。

用少量凡士林密封干燥器，在真空泵与干燥器之间可以加一缓冲瓶以防止氯仿爆沸或由于抽真空使干燥器内外压力变化而造成干燥器破裂等现象发生，然后用真空泵抽气至干燥器内氯仿沸腾。

关闭真空干燥器阀门，在25℃下暗处放置24小时。

熏蒸完成后，打开干燥器阀门（此时应听到空气进入的声音，否则可能熏蒸不彻底，要重新熏蒸），取出装水的小烧杯（或湿润的滤纸）、装有碱液和氯仿的烧杯（氯仿可倒回瓶中重复使用），用真空泵反复抽真空，并打开干燥器以除去土壤中残存的氯仿（止闻不到土壤中的氯仿气味）。

同时称同样量的土壤3份（也可在浸提前再称样），不进行熏蒸处理，作为对照。

3．浸提
熏蒸结束后，熏蒸处理过的土壤样品和未进行熏蒸处理的对照土壤样品转移到100ml塑料瓶中，加入50ml硫酸钾溶液（试剂2）（硫酸钾溶液：土重＝4：1），在振荡机上振荡浸提30min（25℃），用定量滤纸过滤。

同时做不加土壤的空白对照。

4．微生物生物量碳的测定（滴定法）
准确吸取浸提液5.0ml放入消煮管中，加入重铬酸钾标准溶液（试剂3）2.00ml，浓硫酸5ml，摇动试管，充分混匀，在试管上放一小漏斗，以冷凝蒸出的水气。

将试管放入温度为175℃左右的石蜡油浴锅，注意调节使油浴锅温度维持在170－180℃，从试管内容物开始沸腾（有较大气泡）算起，准确煮沸10min，取出试管，稍冷却，拭净试管外部油滴。

将试管内容物倾入150ml三角瓶中，用蒸馏水少量多次洗净试管和漏斗，溶液亦并入三角瓶中。

加水稀释至60－70ml，维持溶液酸度2－3mol（1/2H2SO4）L-1，加入2－3滴邻啡罗啉亚铁指示剂，然后用标准硫酸盐铁溶液滴定，溶液由橙色经过绿色，最后突变为砖红色，即为终点。

四、结果计算
（一）微生物生物量碳的计算
1．有机碳（Oc）的计算
ω(C)＝(V0-V1) ×c×3×ts×1000/m
式中：ω(C)——有机碳（Oc）质量分数，mg·kg-1；
V0——滴定空白样时所消耗的FeSO4体积，ml；
V1——滴定样品时所消耗的FeSO4体积，ml；
c——FeSO4溶液的浓度，mol·L-1
3——碳（1/4C）的毫摩尔质量，M（1/4C）=3mg/mmol；
ts——稀释倍数；100ml/5ml＝20
m——为烘干土质量，g。

2．微生物生物量碳的计算
ω(C)=Ec/K Ec
式中：ω(C)——微生物生物量碳（Bc）质量分数，mg·kg-1；
Ec——熏蒸土样有机碳与未熏蒸土样有机碳之差，mg·kg-1；
K Ec——氯仿熏蒸杀死的微生物体中的碳（C）被今天出来的比例，一般取0.38（Ocio and Brookes,1990）。

注意事项：
①实验结果以土壤干重来表示，计算时一定要考虑土壤含水量；
②如果数据结果变异较大时，要认真分析可能的原因，如：
a 是由于样点的异质性造成的还是操作过程造成的？
b 操作过程中土样采集与处理过程是否一致（土样是否混匀，土中杂质，尤其是根与植物残体是否清除干净等）？
c 熏蒸、浸提是否同批进行？浸提液是否立即进行分析？
方法特点：
优点：氯仿熏蒸提取法测定土壤微生物生物量碳总量快速、简便，适合大量样品分析。

不足之处：无法确定土壤中不同菌类的数量与比例。