转基因植物中删除选择标记基因的研究进展_祁永斌

祁永斌，等． 转基因植物中删除选择标记基因的研究进展
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Baidu Nhomakorabea
M： 选择标记基因； GOI： 目的基因
图 1 超级双元质粒载体及选择标记基因在后代中分离 Fig． 1 Super-binary plasmid and the segregation of selectable marker gene in the transgenic progeny
利用，在转基因筛选和鉴定完成后功能多余。当前转基因植物的标记基因及相关产物对环境污染和食用安
全的潜在影响，已经引起了人们的广泛关注。随着转基因技术的不断发展和人们对转基因植物和食品安全
性的关注，删除转基因植物中的选择标记基因非常重要。文章着重讨论了植物转基因过程中，选择标记基因
的利用，删除选择标记基因的几种方法，包括共转化法、位点特异性重组、染色体内重组、转座子介导的重组、
浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2014，26（5） ：1387 － 1393
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祁永斌，刘庆龙，陆艳 婷，等． 转 基 因 植 物 中 删 除 选 择 标 记 基 因 的 研 究 进 展［J］． 浙 江 农 业 学 报，2014，26 （ 5 ） ： 1387
－ 1393．
DOI：10. 3969 / j． issn． 1004 － 1524. 2014. 05. 43
转基因植物中删除选择标记基因的研究进展
祁永斌，刘庆龙，陆艳婷，金庆生
（ 浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021）
摘 要：选择标记基因广泛应用于植物转基因工程中，然而这些基于除草剂和抗生素类抗性选择标记基因的
自从转基因植物商业化生产以来，凭借其独 特的优势对现代农业生产带来了一场革命。转
基因技术打破了物种之间的生殖隔离，使种质资 源更加优化，从而在植物抗虫害［1］、病害［2］、非生
收稿日期：2014-02-27 基金项目：浙江省科技厅省重大科技攻关项目（0406 计划） （2004C1202-2） ；浙江省农业科学院财政专项 作者简介：祁永斌（1978—） ，男，甘肃临夏人，助理研究员，主要从事水稻遗传育种。E-mail： qi_yongbin@ hotmail． com
QI Yong-bin，LIU Qing-long，LU Yan-ting，JIN Qing-sheng （ Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021， China） Abstract： Selectable marker genes were widely used in the transgenic plants． However，these genes based on the resistance to antibiotic and herbicides are redundant since transgenic plants have been selected and identified． Due to the presence of selectable marker gene and its products，the environment pollution and food safety of transgenic plants are strongly concerned by consumers． With the development of transgenic technology，it is very important to eliminate the selectable marker gene in transgenic plants． In this review，utilization of selectable marker gene，methods of marker gene excision consisted of co-transformation，site-specific recombination，intrachromosomal recombination， recombination by transposon，removal of chloroplast marker gene，regeneration of direct marker-free plants，as well as the developmental directions of this technology were discussed． Key words： selectable marker gene； co-transformation； site-specific recombination； transposon； chloroplast transformation
稳定整合 2 个 T-DNA，进而从转基因后代中分离 选择标记基因。但是，2 个 T-DNA 的连锁程度限 制了分离选择标记基因的效率。因此，需要目的 基因和选择标记基因插入植物基因组后不完全 连锁才可以删除选择标记基因。此外，对于多年 生的木本植物，共转化方法也不适用。
2 位点特异性重组
位点特异性重组已经广泛应用于不同植物 的转基因体系中，是删除选择标记基因的一种有 效途径，由 重 组 酶 和 重 组 酶 识 别 位 点 两 部 分 组 成。重组酶的识别位点由一个回文结构组成，回 文结构的两边有一个 13 bp 的核心序列，重组酶 促进同源 染 色 体 在 识 别 位 点 之 间 发 生 重 组、转 移［20］。目前，已经有 4 种位点特异性重组系统用 于删除选择标记基因；分别是：1） 来自噬菌体 P1 的 Cre / LoxP 系 统［21］，Cre 酶 可 以 识 别 特 异 位 点 LoxP（ 图 2 ） ； 2 ） 来 自 酿 酒 酵 母 的 FLP / FＲT 系 统［22］，FLP 重组酶作用在 FＲT 位点；3） 来自于鲁 氏接合酵母的 Ｒ / ＲS 重组系统［23］，Ｒ 和 ＲS 分别 是重组酶和整合位点；4） 一种来自于噬菌体 Mu 的改良 Gin / gix 重组系统［24］，gix 重组蛋白的表 达不影响转基因植物的分化和生长。在这些重 组系统中，删除选择标记基因首先需要重组酶在 转基因植物中表达。一种方法是，将选择标记基 因构建到两个重组位点之间，与重组酶一并转入 转基因植物； 另 外 一 种 方 法 是，含 有 目 的 基 因 的 转基因植物和只含有重组酶系统的转基因植物 杂交，通过后代分离删除选择标记基因。一项新 的策略是结合两种位点专一性重组系统（ Cre /
1 共转化法
作为删除选择标记基因的一种方法，共转化 法可以通过农杆菌法和基因枪法来实现。主要 是将目的基因和选择标记基因分别构建到不同 的 T-DNA 载体上。基本上有三种方法：1）2 个 T 载体分别用农杆菌法［16］或基因枪法［17］转化到同 一组织；2） 同一农杆菌菌株携带 2 个不同的复制 子转化植物组织［18］；3 ） 将 2 个 T-DNA 构建到同 一个复 制 子 内，成 为 超 级 双 元 质 粒 载 体［19］ （ 图 1） 。以上所有方法都是通过植物的有性生殖，经 过基因重组和分离在转基因植物的后代中，将选 择标记基因删除。因此，共转化法不适用于只有 营养生长的植物。这种方法不仅要求转基因植 物正常可育，同时时间较长。转基因当代植物要
由于整合到植物基因组中的选择标记基因 是一种外源 生 物 系 统，因 此，它 的 传 播 受 到 广 泛
关注。研究 表 明，在 美 国、南 美 等 种 植 转 基 因 抗 草甘膦大豆、棉花、玉米等作物的田间，已经发现 各种抗草甘膦的超级杂 草 （ Amaranthus palmeri， Amaranthus tuberculatus，Ambrosia artemissifolia， Ambrosia trifida，Sorghum halepense，Euphorbia heterophylla） ，其具有竞争性生长优势，使这一地区 的农作物生产受到很大影响［13］，这 也 进 一 步 增 加了这种潜在的抗性基因向近缘种转移的风险。 外源基因可以通过水平传播，使选择标记基因转 入环境，或与之相关的微生物，并作为食物进入 人体细 胞。一 些 研 究 证 明，在 特 定 条 件 下 植 物 DNA 可以转入微生物中［14］。目前，还没有证据 表明选择标记基因对于人类和动物是绝对安全 的，同时也没有证据表明选择标记基因对人类和 动物是有毒害的，在这种选择标记基因危害性不 明朗的情况下，谨慎使用、减少使用或转基因后 剔除选择标记基因具有重要的价值和意义。另 外，除了基因水平转移的风险外，还有外源基因 垂直转移成为 超 级 杂 草 的 危 险［15］。因 此，删 除 选择标记基因不仅可以解决外源基因水平转移 的风险，同时又能降低垂直转移的危险。为了这 个目的，本文重点讨论了几种删除转基因植物中 选择标记基因的方法，包括：共转化法、位点特异 性重组、染色体内基因重组、转座子介导的重组 系统、删除叶绿体转化过程中选择标记基因、无 选择标记基因植株的直接再生等方法。
删除叶绿体转化中选择标记基因，以及无选择标记基因植株的直接再生等。同时，还对这些技术的发展作了
展望。
关键词： 选择标记基因；共转化；位点特异性重组；转座子；叶绿体转化
中图分类号：Q 78
文献标志码： A
文章编号：1004-1524（2014）05-1387-07
Ｒesearch progress of the selectable marker genes eliminated in the transgenic plants
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浙江农业学报 第 26 卷 第 5 期（2014 年 9 月）
物性胁迫［3］等方面取得了显著的效果。但是，随 着转基因植物种植面积的不断扩大，转基因技术 所带来的安全性问题也受到人们的广泛关注。
选择标记基因广泛应用于植物转基因过程 中，其在特 定 的 选 择 条 件 下，使 转 基 因 细 胞 或 组 织区别于非转基因细胞或组织。目前，植物转基 因研究过程中的选择标记基因分为两大类，一般 而言，对 于 那 些 抑 制 转 基 因 细 胞 生 长 的 称 之 为 “负向”选择标记基因，而那些促进转基因细胞生 长的称之为“正向”选择标记基因。根据作用底 物的不同，“负向”选择标记基因又可分为两类： 1） 抗生素类抗性基因，如 hpt 基因（ 潮霉素磷酸 转移酶）［4］、npt Ⅱ 基 因 （ 新 霉 素 磷 酸 转 移 酶）［5］ 等，选择标记基因使转基因的细胞或组织在含有 相应抗生素的培养基上能够正常生长，而非转基 因的细胞或组织由于不能分解这些抗生素从而 导致死亡；2） 除草剂类抗性基因，如 bar 基因［6］ （ 草丁膦-N-乙酰转移酶） 、epsps 基因［7］（5-烯醇丙 酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶） 等，这类基因使转基 因的细胞或组织在添加有除草剂的培养基上正 常生长，而非转基因的细胞或组织因不能降解除 草剂而死亡。“正向”选择标记基因根据其来源 不同也可分为两类，一是来源于植物本身的选择 标记基因，例如：来源于芹菜的 M6PＲ 基因（ 甘露 糖-6-磷酸还原酶）［8］、来源于拟南芥的 AtTPS1 基 因（ 海藻糖-6-磷酸合成酶）［9］等，这些选择标记 基因使转基因细胞在特殊的培养条件下，能够利 用甘露糖、高 浓 度 葡 萄 糖 等 正 常 生 长，而 非 转 基 因细胞则不能利用这些糖源正常生长或发育异 常。二是来源于非植物的选择标记基因，例如来 源于大肠杆菌的 PMI（6-磷酸甘露糖异构酶） 基 因［10］，链霉菌的 xylA（ 戊醛糖异构酶） 基因［11］，酿 酒酵母 的 MPＲ1 （ 酵 母-N-乙 酰 转 移 酶） 基 因［12］ 等，这些选择标记基因与来自植物本身的“正向” 选择标记基因相似，都能赋予转基因细胞或组织 在特定条件下能够正常生长的优势。目前，受选 择效率低下和植物转化再生体系不成熟等因素 的限制，“正向”选择标记基因应用较少，尤其是 商业化生产过程中，主要还是以抗生素类和除草 剂类抗性基因等“负向”选择标记基因为主。