植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定

《生物化学》实验五

植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定

学生：吴潇潇学号：0812134 指导老师：张芬琴

（河西学院生命科学与工程系 08（1）班甘肃张掖 734000）摘要：以三叶草和草坪草的叶片为材料，分别采用丙二醛法、考马斯蓝法及酶活力测定的方法对三叶草及草坪草叶片内丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力进行对比测定。实验结果表明：草坪草内丙二醛含量高于三叶草的，且都在532nm处吸光值最大；三叶草叶片内蛋白质含量高于草坪草叶片的；三叶草叶片中过氧化物酶活力大于草坪草叶片的。

关键词：三叶草草坪草丙二醛含量蛋白质含量过氧化物酶活力对比

引言：

丙二醛 (MDA)，无色针状晶体，熔点 72～74℃，一般含两个结晶水，60℃下真空干燥可得无水物，易潮解，纯的丙二醛在中性条件下稳定，但在酸性条件下不稳定。由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而得，可在高真空下升华精制，主要用于医药中间体、感光色素的原料。与蛋白质不相容，有潜在的致癌性。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。

蛋白质（protein）由C、H、O、N组成，一般蛋白质可能还会含有P、S、Fe、Zn、Cu、B、Mn、I等。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，都是由20种标准氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新并时刻处于动态平衡中。

酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实

际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适.

1.材料与方法

1.1 材料采集及使用试剂

1.11材料采集：实验材料三叶草与草坪草分别取其叶片于自来水中冲洗，然后用吸水纸将水吸干待用。

1.12试剂：0.5%硫代巴比妥酸溶液 20%三氯乙酸（TCA）

1mg/ml牛血清蛋白溶液考马斯亮蓝溶液

0.01mol/ml磷酸缓冲液 0.02mol/ml愈创木酚一定浓度过氧化氢

溶液

1.2 方法

1.21三叶草丙二醛提取：分别取0.5克三叶草与草坪草叶片于研钵中，加石英砂和1ml蒸馏水，研成匀浆，转移到试管中，再用1.5ml蒸馏水分两次洗研钵，合并提取液→加入

2.5ml0.5%硫代巴比妥酸溶液, 摇匀→沸水加热10min(自有气泡开始计时)，冷却至室温→离心15min取上清液量其体积V→以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白对照分别测其在450nm、532nm、600nm下的吸光度。

1.22蛋白质含量的测定：如（1）制的提取液后，分别加入5ml缓冲液，再于12000r/min 分离提取上清液，并量上清液体积，用于蛋白质含量测定和酶活力测定。如下表配置好溶液后摇匀，5minhou 后以1号管为空白对照,在595nm 处测定POD值。

表1.221溶液标准曲线的测定及溶液OD值

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8

100ug/ml标准蛋白（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 样品（ml）0.2 0.2 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 考马斯亮蓝试剂（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A595nm 0. 0.137 0.288 0.360 0.524 0.604

图1.221标准蛋白质含量及吸光值曲线

图1.222三叶草与草坪草蛋白质含量

1.23过氧化物酶活力的测定：如表1.231所示读取470nm处吸光值。

表1.231溶液配置及其吸光值

试剂对照管样品（三叶草）样品（草坪草）

0.01mol/ml磷酸缓冲液/ml 2.4 2.3 2.3

0.02mol/ml愈创木酚/ml 0.5 0.5 0.5

提取酶液/ml 0 0.1 0.1

过氧化氢/ml 0.1 0.1 0.1

混合后读出OD值，3min后再读出OD值，作差OD值差0 0.927 0.236

1.24SDS-PAGE电泳实验步骤：

1.241安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。

1.242配胶：本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。

表1不同浓度分离胶、浓缩胶的配制

试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种

试剂/ml 配制10ml浓缩胶所需试剂

5% 7.5% 10% 15% 3% 分离胶贮液

（30%Acr-0.8%Bis)

3.33 5.00 6.66 10.00 -

分离胶缓冲液

（pH8.9Tris-HCl）

2.50 2.50 2.50 2.50 -

浓缩胶贮液

（10%Acr-0.5%Bis）

- - - - 3.0

浓缩胶缓冲液

（pH6.7 Tris-HCl）

- - - - 1.25 10% SDS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.10 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 重蒸馏水11.87 10.20 8.54 5.20 4.60