辣根过氧化物酶

用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法

辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。

将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。

Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。

至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP 注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联

系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。因此我们用HRP法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。对针刺足三里穴区作胃肠手术或针刺治疗胃肠疾患进行了形态学基础的研究。

一、辣根过氧化物酶的注入问题

注入的浓度及时间：HRP注入法在追溯中枢神经联系和周围神经联系有所不同。中枢神级系统内HRP需要用蒸馏水或生理盐水配成高浓度的溶液, 但也有用pH7.4的磷酸缓冲液做溶剂者[8]。其浓度是30%-50%，注射量是0.05μl-0.1μl, 0.1μl-0.25μl，最大量可以是0.5μl。住射速度很慢, 一般约为0.1μl/10分。Nauta认为可慢至0.05μl/h, 注射后留针15-30分钟。

HRP法在周围神经联系方面, 所用的HRP配制法与中枢相同, 是用蒸馏水或生理盐水配制, 但浓度较低, 1%、5%、10%, Yamamato及Teiji在猫胃壁注入时所用浓度为20%-30%, 注入时间没有说明。而在心脏窦房结及房室注入HRP时浓度为30%-50%。Elfvin在荷兰猪的肠系膜下神经节内注入的浓度25%-30%在5-10min内注入完华。

我们的实验, 是用8-10mgHRP溶于80-100μl的蒸馏水, 浓度是10%注入猫、兔胃壁内, 注入速度是1μl/min, 所得的结果是比较满意的, 经过灌流及孵育等过程, 脊神经节细胞内的HRP酶标颗粒在光学显微镜明视野下, 细胞质内核的周围呈棕黑色颗粒, 暗视野下观察

此棕黑色颗粒则成明亮的小点（参看本期《胃交感内脏传入神经元》的节段性一文附图》。以同样的浓度浸胞足三里穴区的腓深神经断端, 也可以在脊神经节细胞内得到同样的结果。

二、HRP注入后动物的存活时间问题

关于HRP的运输问题, 一般认为是通过神经细胞体与突起末梢间存在着的双向流动的轴浆流axoplasmic flow来运送的。无沦是树突还是轴突都有这种现象[9]。注射部位的HRP被神经末梢及神经终末部分无髓段细轴突以胞饮方式吸收。

在周围神经注射后存活时间：日本学者里见肇、山本悌司在胃壁注入HRP后2-3天在迷走背核及孤束核的细胞内有酶标颗粒,Law，Furst将HRP注入大鼠牙髓腔后1-2天在三叉神经半月神经节内看到标记细胞：Elfvin，将HRP注入肠系膜下节, 术后24-48h在脊神经节细胞内看到酶标颗粒。Dalsgaard[10]将HRP注入豚鼠肠系膜下节及交感颈上节后,48小时后在脊髓五个交感核内看到酶标颗粒。根据我们实验室的经验, 较大动物如兔和猫存活的时间应当长, 将HRP注入胃壁, 存活4-5天脊神经节细胞内酶标颗粒非常清晰。甚至存活7天的动物仍可见到脊神经节细胞及纤维内有酶标颗粒的出现。因此我们认为用HRP追溯周围神经联系时, 较大动物（猫、兔）存活时间适当长些。

三、固定液的问题

用HRP法显示神经细胞内标记颗粒, 无论是中枢或周围部分, 固定液的选择是个重要的关键, 在文献中多采用多聚甲醛、戊二醛混合液。戊二醛能较好的固定组织超微结构, 多用于电子显微镜技术, 虽

然对酶有一定的破坏作用, 但仍然有相当程度的酶活性可以保存下来。其缺点是穿透能力太小, 对大的组织块固定, 多在固定液中加入穿透力强的多聚甲醛来补其不足。

多聚甲醛为甲醛聚合物, 不溶于水, 但加水煮沸则可以解聚成甲醛单体而溶解, 因此用多聚甲醛灌流时须煮沸之。甲醛对酶的破坏作用比戊二醛小, 但在室温下仍可破坏HRP的活性, 所以Straus（64年）[11]认为多聚甲醛灌流液应在0-4℃时, 对动物进行灌流, 可保持HRP的活性。

多聚甲醛及戊二醛的浓度问题在文献中各不相同。用HRP法探索中枢神经的联系时, 文献报导多聚甲醛的浓度为0.4-2.5不等。至于所用的缓冲剂皆为磷酸盐缓冲液, 因为多聚甲醛在弱碱性环境下对组织固定较好, 所以pH值多在7.2-7.4之间。

在周围神经系统用HRP法显示酶标记时Elfvin和Daisgaard（77年）等人只用3-5%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate(卡钻的纳)缓冲剂内进行灌流, 可得到较好的结果。Lewreoe Furst（75年）用1%多聚甲醛加入1%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate缓冲剂内（pH为7.5）进行灌流, 效果也甚好。日本的里见肇及山本悌司在胃浆膜下注入HRP观察延髓迷走背核及孤束核的HRP标记颗粒时则用2%多聚甲醛及0.5%的戊二醛作为固定液。我们实验室将里见肇的方法加以改良, 单独用2%多聚甲醛, 不加戊二醛, 溶于0.1M磷酸盐缓冲剂内pH为7.2-7.3, 在灌流动物时用冰将固定液冷却至0-4℃进行灌流得到满意的结果。对于是否加戊二醛的问题, 我们认为戊二醛和多聚甲醛都可以做为固定剂, 戊二