洋葱伯克霍尔德菌群3种鉴定方法的比较

1前言

伯克霍尔德菌,原称为洋葱假单胞菌,由美国植物病理学家Burkholder于1949年首次发现。它是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。随着细菌分类技术的发展,伯克霍尔德菌属包括洋葱伯克霍尔德菌群(B.cepacia complex)、假鼻疽伯克霍尔德菌(B.pseudomallei)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.gladioli)、鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)、泰国伯克霍尔德菌(B.thailandensis)等60多个菌种,具有复杂多样性,既有人畜共患病原菌,也有植物病原菌及环境分离株,临床上以洋葱伯克霍尔德菌较为常见[1,2]。洋葱伯克霍尔德菌群是基因型不同但表型相近的一组非发酵复杂菌群。2001年, Coneyet等利用rRNA-DNA杂交全细胞电泳和细菌表型标志物等方法将洋葱伯克霍尔德菌群分为9种基因型[3,4]。

洋葱伯克霍尔德菌群广泛存在于自然界和医院环境中,是一种常见的条件致病菌,常引起囊性纤维化疾病和慢性肉芽肿。在医学领域洋葱伯克霍尔德复合群感染已呈上升趋势,可引起多种部位的感染,可引起爆发流行,对多种抗生素具有耐药性,治疗难度大[5,6]。

洋葱伯克霍尔德菌群3种鉴定方法的比较

杨丹婷苏嘉妮李婉珊钟卫烨王曦韦云丁清龙周露*

(广东省食品检验所广东广州510435)

摘要为了比较VITKE2COMAPCT、VITEK MS质谱、16s rDNA基因测序3种方法鉴定洋葱伯克霍尔德菌群的异同,挑选15株从米面制品、淀粉及其制品中分离得到的洋葱伯克霍尔德菌群的菌,分别用VITEK2COMPACT、VITEK MS质谱和16s rDNA基因测序进行鉴定。结果显示,VITEK2 COMPACT只能鉴定到群水平,可信度88%—99%;VITEK MS质谱可鉴定到种水平,鉴定置信度99%; 16s rDNA基因测序可鉴定到种水平,序列同源性能达到99%以上,但每株菌16s序列能匹配到2种以上洋葱伯克霍尔德菌群里的菌。所以,3种鉴定方法中,VITEK MS质谱法可鉴定出洋葱伯克霍尔德菌群里的不同种,该方法结果准确,时效性高,操作步骤简单。

关键词洋葱伯克霍尔德菌群;VITEK2COMPACT;VITEK MS;16s rDNA基因测序

中图分类号R446.5

Comparison of Three Identification Methods of Burkholderia Cepacia Group

YANG Danting,SU Jiani,LI Wanshan,ZHONG Weiye,WANG Xi,WEI Yun,

DING Qinglong,ZHOU Lu*

(Guangdong Institute of Food Insepetion,Guangzhou,Guangdong,510435,China) Abstract:In order to compare the differences and similarities among VITKE2COMAPCT,VITEK MS and16s rDNA gene sequencing in the identification of Burkholderia cepacia,15strains of Burkholderia cepacia isolated from rice noodles,starches and their products are selected and identified by VITEK2 COMPACT,VITEK MS and16s rDNA gene sequencing,respectively.The results show that VITEK2 COMPACT can only identify the population level with88%—99%reliability;VITEK MS can identify species level with99%confidence;16s rDNA gene sequencing can identify species level with99% homology,but16s sequence of each strain can match more than two species of Burkholderia cepacia. So,among the three identification methods,VITEK MS can identify different species of Burkholderia cepacia group,and it has the advantages of accurate results,high timeliness and simple operation steps. Key Words:Burkholderia Cepacia Group;VITKE2COMPACT;VITEK MS;16s rDNA Gene Sequence

第一作者E-mail:451224676@;*通信作者E-mail:zhoulu1982@

项目基金:广东省食品药品监督管理局科技创新项目(2018ZDZ07、2018ZDZ06)

收稿日期:2019-04-05

菌株编号

菌株来源样品

样品抽检地区抽样环节1

面皮

广东江门

餐饮

在2018年度广东省食品检验所的专项抽检米面制品、淀粉及其制品专项中发现,广东省米面制品、淀粉及其制品中存在伯克霍尔德菌属污染的风险较高,特别是洋葱伯克霍尔德菌群。目前,国内的检验标准中,只有进出口口腔清洁类产品和进出口化妆品中有洋葱伯克霍尔德菌的检验标准,且鉴

定的主要方法是生理生化实验[7,8]。2014年,高业成等建立了可以有效排除杂菌干扰检测出食品样品中

的洋葱伯克霍尔德菌的方法[9]

。2016年,胡娟等用生化实验结合PCR 方法鉴定饮水中洋葱伯克霍尔德菌[10]。在食品行业没有洋葱伯克霍尔德菌群鉴定的标准方法。因此,探究准确高效的洋葱伯克霍尔德菌群鉴定方法,可为食品标准的建立提供参考依据,提高食品安全保障。

目前,传统生化方法和临床上应用的VITEK 2COMPACT 不能准确区分洋葱伯克霍尔德菌群基

因型[11]。VITEK MS、分子生物学手段是近年发展起来并已广泛应用于细菌鉴定的方法。本文对从广东省米面制品、淀粉及其制品中分离的洋葱伯克霍尔德菌群分别进行VITEK 2COMPACT、VITEK

MS 质谱鉴定和16s rDNA 基因测序,其中,VITEK 2COMPACT 只能鉴定是洋葱伯克霍尔德菌群,不能进一步细化;16s rDNA 虽然可以鉴定出具体菌种,但由于序列相似性太高,鉴定结果不够

准确;VITEK MS 质谱可直接鉴定到种水平,鉴定置信度99%,方便快捷。2材料与方法2.1仪器与试剂

VITEK 2Compact 自动微生物快速检测分析系统(法国生物梅里埃股份有限公司);VITEK MS 质谱仪(法国生物梅里埃股份有限公司);Nano 核酸蛋白分析仪(日本岛津中国公司);Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国伯乐公司);T100PCR 仪(美国伯乐公司)。

脑心浸出液肉汤(BHI)(广东环凯微生物科技有限公司);VITEK 2COMPACT GN 鉴定卡(法国梅里埃公司);哥伦比亚血琼脂平板(北京陆桥技术股份有限公司);基质液CHCA(法国梅里埃公司);细菌基因组DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)。

实验菌株:均来源于2018年广东省米面制品、淀粉及其制品抽检样品。具体见表1。

2.2

实验方法

用BHI 将实验需用菌株进行复苏。

2.2.1

VITEK MS 质谱仪鉴定

在48孔靶板质控孔涂校准菌(在哥伦比亚血琼

脂平板上培养24h 新鲜的单个大肠埃希氏菌ATCC-8739菌落),涂匀后加1μL 基质液CHCA,每16孔区域涂一个质控孔;在样品孔涂匀待测菌,每涂一个孔加一次1μL 基质液CHCA,待基质液干透后上机。2.2.2

16s rDNA 基因测序

(1)DNA 提取。DNA 提取方法参照细菌基因组DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)操作说明进行。

(2)DNA 浓度测定。取3.5μL 提取的DNA 于核酸蛋白分析仪上,以无菌水清洗、DNA 提取试剂TE 作空白,测定DNA 浓度。

(3)PCR。参照PCR 试剂盒说明书。

扩增体系:DNA 模板2μL,上游引物(27F)

2μL,下游引物(1492R)2μL,2×PCR DSmix 25μL,用超纯水补足至50μL。

扩增条件:94℃,3min;94℃,30s;60℃,

30s;72℃,2min,30个循环;72℃,10min。

(4)电泳。取5μL PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,以2000bp Marker 作为参照。电泳条件:

120V,40min。电泳结束后,于凝胶成像装置成像。(5)测序。PCR 产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。3结果与分析3.1

VITEK 2COMPACT 生化鉴定结果与分析在VITEK 2COMPACT 生化鉴定实验中,15株

表1实验菌株信息

(续表1)

菌株编号

菌株来源样品样品抽检地区抽样环节23456789

101112131415河粉竹篙粉红薯粉螺蛳粉猪肠粉河粉桂林米粉米粉濑粉老鼠粉米粉肠粉河粉新楼山水河粉

广东清远广东佛山广东梅州广东清远广东佛山广东佛山广东东莞广东佛山广东东莞广东河源广东河源广东肇庆广东清远广东阳春

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