植物病原线虫的分离方法及形态观察实验

植物病原线虫的分离

一、目的要求

了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织中分离线虫的常用方法。学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。

二、基本原理

植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中，分离线虫的方法有许多，要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出以外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将线虫从植物组织、土壤中分离出来。

三、材料、试剂与仪器

1．实验材料感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。

2．仪器或实验用具解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。

3．试剂线虫固定液。

四、实验操作

1．直接观察分离

对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等，可直接用挑针从植物组织中挑取，也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取，对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等，需在解剖镜下，用竹针或毛针直接挑取。

取感染根结线虫的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡过夜），剥开皮层，观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖镜或显微镜下观察是否为根结线虫雌虫。

2．漏斗分离法

该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置是将直径10~ 15cm 的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10 cm 的橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。

（1）将植物材料切碎用双层纱布包好，浸在盛满清水的漏斗中，或在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中，分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸，上面加一层土样。

（2）加水，静止24h。

提示由于趋水性和自身的重量，线虫就离开植物组织或土壤，沉降到漏斗底部的橡皮管中。

（3）打开弹簧夹，慢慢放出底部约5 ml水样于平皿内。

（4）在解剖镜下观察分离到的线虫。若线虫数量太少，可将水样倒入离心管中，在1500rpm 离心机中离心3 min，倒掉上层清水，将下层沉淀物悬浮后倒入平皿或记数皿中，在解剖镜下观察记数，然后将线虫用毛针或毛笔挑入盛有固定液的小玻璃管中备用。

提示该方法也可用于分离土壤中的线虫，尤其是分离较为活跃的线虫。

3．培育分离法

对于用漏斗分离法不易分离到的线虫，如根结线虫和孢囊线虫的雄性成虫等，可采用培育分离法。

将病根采回后洗去表面土粒，放在培养皿中湿润的滤纸上培育3d，用少量清水冲洗组织和皿底，检查水中线虫。或将组织放在有螺旋盖的玻瓶中，加入几毫升清水，盖不要旋紧，在室温（20~ 25℃）下培育3d，然后加50 ml清水，盖紧盖子并轻轻振荡，后倒出悬浮液使其顺序通过40目和325目网筛，用小水流轻轻冲洗325目网筛背面，收集到记数皿或烧杯中，直接检查或离心后检查。

提示从土壤中得到病根后要马上冲洗和培育，因为24h后，有50%的线虫会从根里爬出，冲洗时便被冲掉了。

4．浅盘分离法

该方法原理与漏斗分离法一样，但分离效果更好，而且泥沙等杂物较少。用两个不锈钢浅盘套放在一起，上面一个是筛盘，它的底部是筛网，网目大小为10目/英寸，下面一个是稍大的盛水盘。也可在培养皿上放置一个稍小的做成浅盘状的金属网，网与培养皿底部保持一定距离。

分离时将线虫滤纸放在网上用水淋湿，上面再放一层餐巾纸，将要分离的土样或植物材料放在餐巾纸上，在两盘之间缝隙中加水，淹没土样或植物材料，在室温（20~ 25℃）下保持3d，去掉筛网后，将下面浅盘中的水样过筛（上层为25目，下层为400目），将下层筛上的线虫用小水流冲洗到记数皿中，观察记数。

5．漂浮器分离法

对于没有活动能力的孢囊线虫的孢囊可采用漂浮器分离法（Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法），该法需要特制的分离装置。分离时先将漂浮筒内盛满清水，将100g 风干的土样放在上筛中，用强水流冲洗土样，使其全部洗到漂浮筒内，并从环颈水槽流到承接的细筛（100目）中，再用细水流冲洗一会，使漂浮物全部流入细筛。将细筛中的孢囊等漂浮物用水洗入烧杯或三角瓶中，再倒入铺有滤纸的漏斗中，用毛笔收集并观察滤纸上的孢囊。

提示漂浮分离的土样必须要风干，否则孢囊不能在水中漂浮，需用比重小于1的溶剂。

五、所需时间流程

1．漏斗分离样品浸泡放出水浸液、离心镜检

2．培育分离样品培育过筛、收集、镜检

3．浅盘分离样品浸泡样过筛、收入记数皿、镜检

4．漂浮分离10 min左右。

六、实验作业

比较各种线虫分离方法的优缺点。

一、目的和要求

识别主要植物线虫病的症状和病原线虫的形态特征。包括雌雄同型及异型线虫.

二、材料和用具

草莓芽干尖线虫（Aphelenchoides besseyi）或珠蓝线虫；小麦粒线虫（Anguina tritici），破坏性茎线虫（Ditylenchus destructor），寄主甘薯，南方根结线虫（Meleidogyne arenaria），寄主花生等；大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）；长针线虫(Longidorus sp.）；毛刺线虫（Trichodorus sp.）。

寄生性线虫病的危害状标本或幻灯片。

线虫的固定液有多种，常用的有FA、FAA和TAF等三种：

（1）FA液：福尔马林（36％甲醛）10ml，蒸馏水90ml；

（2）FAA液：福尔马林10ml，冰醋酸1ml，蒸馏水89ml，

（3）TAF液：三羟基乙胺2mi，福尔马林7m1，蒸馏水91ml。

三、内容与方法

1 线虫形态的观察

（1）粒线虫属（Anguina）观察由小麦粒线虫危害小麦引起的症状，注意小麦受害部位，受害的茎叶有无扭曲或畸形？虫瘿的外形与麦粒有什么区别？

取虫瘿一个，用刀片切开或挑针挑破，挑取虫瘿内部的白色棉絮状物于载玻片上的水滴中盖上盖玻片，置于低倍镜下镜检，可见到成虫、卵和幼虫。雌虫、雄虫均为线形，雌虫体形较雄虫粗大，往往卷曲，体内的卵巢顶端弯曲。雄虫昆部有交合刺，交合伞几乎包到尾尖。（2）茎线虫属（Ditylenchus）

观察甘薯茎线虫（D．destructor）危害甘薯的症状，剖开病薯可见到条点状褐色或白粉干腐症状，挑取少量组织于载玻片的水滴中，加盖玻片镜检，可见到卵、幼虫、成虫等各个虫态。甘薯茎线虫雌雄同型，都是线形，雌虫稍粗大，尾端尖细。注意口针、食道球形态，肠和卵巢平行，单卵巢，卵单行排列。雄虫较细小，尾部可见交合刺、交合伞，交合伞后端距虫体末端有一定间隔。因虫体很小，观察内部器官需用高倍镜。观察示范镜下的雄虫尾部形态。

（3）滑刃线虫属（Aphelenchoides）有各种危害状，例如水稻(Rice)干尖线虫（A．besseyi）引起水稻(Rice)干尖线虫病，以剑叶的干尖最明显，剑叶尖端2－6厘米一段变为白色。干枯卷缩，幼穗形成时线虫侵入颖壳内，引起秕粒或不很充实；菊叶线虫（A.ritzemabosi）为害菊的叶片，使叶片组织坏死。

镜检水稻(Rice)干尖线虫或珠蓝线虫，观察口针、食道球的形态特征、雄虫尾部的交合刺，有无交合伞？

（4）胞囊线虫属（Heterodera）观察大豆胞囊线虫（H．glycines）的危害症状。

挑取病根上的雌虫，肉眼可见到线虫头部已钻入寄主组织，虫体外露，多为柠檬形，黄褐色。